劉儲睿，任文靜，孫 珍

（大連工業(yè)大學生物工程學院 遼寧大連116034）

酒花是啤酒釀造過程中的不可或缺的原料，一方面賦予啤酒特殊的苦味和獨特的口感，另一方面還是天然的抑菌劑，可以抑制啤酒發(fā)生腐敗[1]。酒花物質通過質子載體功能使跨膜質子梯度和質子驅動力減小，由此而引起的營養(yǎng)運輸動力不足使酒花敏感菌死亡[2]。酒花抗性菌株中短乳桿菌是代表菌株，同時也是啤酒發(fā)酵工業(yè)中對啤酒質量的影響較為嚴重的啤酒腐敗菌之一[3]。酒花抗性菌可以通過細胞膜上質子轉運H+-ATPase 酶來維持跨膜pH 梯度，保證營養(yǎng)運輸動力[4]，以及通過Sami等[5]發(fā)現(xiàn)的與酒花抗性相關的膜上轉運蛋白HorA 和HorC 排出進入胞內的苦味酸，降低苦味酸的滲入速度以維持菌體的正常生長[6]。此外，啤酒中的檸檬酸、丙酮酸、蘋果酸和精氨酸等可以被酒花抗性菌所利用，為轉運蛋白以及H+-ATPase酶產生大量能量[7]。還有研究表明，在酒花抗性菌株中，基因hitA 編碼蛋白將二價陽離子排出，從而限制酒花苦味酸與質子的交換，減少酒花對細胞的危害[8]。

細胞膜在維持細胞結構功能的完整性以及細胞的能量傳導等方面有著重要的作用，而調節(jié)細胞膜脂肪酸的分布是細胞抵御脅迫的一種重要的應激反應，這種應激反應在各種環(huán)境脅迫中被發(fā)現(xiàn)。植物乳桿菌在高溫和低pH 值條件下會改變處理細胞的脂肪酸分布，特別是不飽和與飽和脂肪酸的比例[9]。乙醇環(huán)境會使細胞不飽和/飽和比降低，脂肪酸C12：0的比例增加，C18：1的比例減少[10]。在冷脅迫下，植物通過增加不飽和脂肪酸的比例來保護機體[11]。在100%甲苯中，菌株E13T 通過飽和直鏈脂肪酸的增加，促使細胞膜變硬，以抵御甲苯毒性[12]。而對于酒花脅迫對細胞膜脂肪酸的影響鮮有報道。

本文以實驗室從腐敗啤酒中分離得到的酒花抗性菌株短乳桿菌49（Lactobacillus brevis 49）為出發(fā)菌株，通過改變酒花質量濃度，確定短乳桿菌49 在應對酒花脅迫環(huán)境時胞外pH、胞內ATP 以及細胞膜組成的變化，最終闡明短乳桿菌對酒花脅迫環(huán)境脅迫的適應性及其調控機理，進而為啤酒污染菌的抗酒花脅迫機制以及對啤酒腐敗菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生物與試劑

菌種：短乳桿菌49（Lactobacillus brevis 49，縮寫為L.brevis）從腐敗啤酒中分離得到，與短乳桿菌ATCC 14869 和ATCC 367 具有99%的同源性，目前保存在大連工業(yè)大學微生物資源與生物催化實驗室。

皂化試劑：氫氧化鈉（優(yōu)級）22.5 g，甲醇（色譜純）75 mL，去離子水75 mL；甲基化試劑：鹽酸（6 mol/L）32.5 mL，甲醇（色譜純）27.5 mL；萃取試劑：正己烷（色譜純）100 mL，甲基叔丁基醚（色譜純）100 mL；洗滌試劑：氫氧化鈉（優(yōu)級）3.6 g，去離子水75 mL；飽和氯化鈉溶液：氯化鈉（優(yōu)級）20 g，去離子水50 mL。

1.2 試驗用培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基：酵母浸膏0.4%、D-麥芽糖0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.8%、無水葡萄糖2%、無水乙酸鈉0.5%、吐溫-80 0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、檸檬酸三銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、水、pH 6.8，于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.2 不同酒花脅迫條件培養(yǎng)基 在MRS 培養(yǎng)基中分別加入0，10，20，30，60 mg/L 的酒花浸膏（大連華潤雪花啤酒有限公司贈送啤酒花產品，該產品由啤酒花的二氧化碳提取物制成，含有9%的異α 酸），于121 ℃條件下滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

722s 可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；pH 計PHS-3C，上海儀電科學儀器股份有限公司；高速離心機5408-R，德國Eppendorf 公司；高效液相色譜儀1260、氣相色譜儀6850A，美國安捷倫公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 短乳桿菌49 生長曲線以及發(fā)酵液pH 值的測定 將短乳桿菌49 接種于0，10，20，30，60 mg/L MRS 培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)，從第1天至第7 天每天取一定量混勻發(fā)酵液，用紫外分光光度計測定OD600值，以獲取短乳桿菌49 的生長曲線圖。測定發(fā)酵液pH 值。

1.4.2 短乳桿菌49 胞內ATP 的測定 短乳桿菌49 于不同酒花質量濃度下，在穩(wěn)定期（第7 天）取一定量混勻的發(fā)酵液，按照Beyotime（中國）公司購買的ATP 檢測試劑盒使用方法進行細胞獲取、裂解，并將裂解液吸取20 μL 于96 孔板進行ATP檢測。

1.4.3 短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸的提取 將短乳桿菌49 接種于0，10，20，30，60 mg/L MRS 培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜止培養(yǎng)，在穩(wěn)定期（第7 天）取一定量混勻的發(fā)酵液，4 ℃條件下8 000 r/min 離心10 min，去離子水洗滌2 遍，收集菌體，然后測定其膜脂肪酸組成。

1.4.4 細胞膜脂肪酸組成檢測 參照美國MIDI公司的微生物脂肪酸甲酯氣相色譜鑒定方法[13]進行細胞脂肪酸甲酯衍生化和氣相色譜檢測。碳鏈長度按公式（1）計算。

式中，F(xiàn)AP——脂肪酸組成百分數(shù)；C——脂肪酸碳原子數(shù)。

膜脂肪酸的流動指數(shù)（U/S）是以不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值來計算。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0（美國IBM 公司）軟件進行單因素方差分析和均值間顯著性差異檢驗（P＜0.05），做Pearson 相關分析，分析均值間的相關性。

2 結果與分析

2.1 酒花對短乳桿菌49 細胞生長的影響

圖1 酒花對短乳桿菌49 細胞生長的影響Fig.1 Effect of hops on the growth of Lactobacillus brevis 49

在酒花的化學成分中，酒花苦味酸是啤酒花抑制微生物生長的重要物質[14]。未解離的酒花苦味物質（Hop-H）進入細胞解離成H+和陰離子（Hop-），驅散跨膜pH 梯度，影響營養(yǎng)物質通過質子泵進入細胞[7]。短乳桿菌49 接種于5 個酒花梯度培養(yǎng)基（0，10，20，30，60 mg/L）中，使用紫外分光光度計測得第1 天至第7 天的OD600值，得到其生長曲線。從圖1可看出含酒花的培養(yǎng)基對短乳桿菌49 有抑制作用，且酒花質量濃度越高抑制作用越顯著，細胞生長的對數(shù)期也隨酒花質量濃度的升高而變長。這是因為酒花苦味酸物質滲入短乳桿菌49 細胞中，短乳桿菌49 需要消耗更多的能量提供給轉運蛋白HorA 與HorC 多藥抗性轉運蛋白，或是質子轉運H+-ATPase 酶維持跨膜pH梯度以抵抗酒花苦味酸[15]，從而造成其細胞生長緩慢。啤酒中的啤酒花苦味酸濃度一般在17～55 mg/L 左右。選取60 mg/L 的酒花質量濃度，培養(yǎng)5 d，其培養(yǎng)液OD600可達0.78，當酒花質量濃度超過60 mg/L 時，未檢出活菌落，OD600為0。

2.2 酒花對短乳桿菌49 胞外pH 及胞內ATP 的影響

為了探究酒花對短乳桿菌49 胞內外的影響，對短乳桿菌49 穩(wěn)定期胞內ATP 和胞外pH 值進行檢測。從圖2可看出發(fā)酵初期（第0 天）酒花質量濃度越高，pH 值越低，60 mg/L 培養(yǎng)基的pH 6.5，0 mg/L 的培養(yǎng)基pH 6.8，這是由于酒花物質為弱酸性。隨著發(fā)酵時間的延長，pH 值呈下降趨勢，這并不是單個因素造成的。由于短乳桿菌49在生長過程中不斷產酸，若是蘋果酸、乳酸、琥珀酸等會造成pH 值下降[15]。此外，酒花進入細胞內解離成H+和Hop-，HorA、HorC 和膜上質子轉運H+-ATPase 酶，能將胞內積累的酒花苦味酸及質子由胞內排出細胞外，造成pH 值的下降。圖3中受酒花脅迫的短乳桿菌49 胞內ATP 含量比不受酒花脅迫的低1 個數(shù)量級，尤其是0 mg/L 與10 mg/L 的OD600相差不多，而前者ATP 含量為743 nmol/L，后者為172.7 nmol/L。這是由于HorA、HorC 和膜上質子轉運H+-ATPase 酶的酒花抗性作用需大量的ATP 供能，造成胞內ATP 之間的顯著差異。而隨著酒花質量濃度的增大，影響菌的生長，ATP 測試取樣量較少，可能存在ATP 測量的誤差。圖2中，酒花質量濃度越高發(fā)酵期間（除零點外）pH 值越高，這是由于酒花質量濃度的增大導致酒花脅迫強度也增大，對短乳桿菌49 的抑制作用越強，存活率下降，造成菌數(shù)目的差異。較少的菌產生的有機酸少，同時膜上酒花相關轉運蛋白及膜上質子轉運H+-ATPase 酶泵出H+的能力被減弱，最終導致高濃度的酒花pH 值也高。

圖2 酒花對短乳桿菌49 胞外pH 的影響Fig.2 Effect of hops on extracellular pH of Lactobacillus brevis 49

圖3 酒花對短乳桿菌49 胞內ATP 的影響Fig.3 Effect of hops on the amount of intracellular ATP of Lactobacillus brevis 49

2.3 酒花對短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸鏈長的影響

為探討不同酒花質量濃度對短乳桿菌49 細胞膜組成的影響，測定第7 天不同酒花質量濃度下所獲菌體的膜脂肪酸組分的相對含量（表1）以及酒花對平均鏈長、中長鏈、脂肪酸奇偶性所占比例的影響（表2）。從表1可看出短乳桿菌49 的主要的脂肪酸組成為C16和C18，占到總脂肪酸組成的50%左右，且棕櫚酸C16：0與硬脂酸C18：0占絕對優(yōu)勢。隨著酒花質量濃度的升高，C18與C20所占比例增加，尤其是C20有顯著的增長趨勢，在沒有酒花抗性的培養(yǎng)基中接近于0%的C20在60 mg/L 酒花質量濃度中達到23.59%。C19相較于對照組脂肪酸比例有顯著的提升，且短乳桿菌49 的C19脂肪酸中環(huán)狀脂肪酸比例占總C19脂肪酸的90%以上，因此主要是環(huán)狀脂肪酸C19在酒花脅迫環(huán)境中有明顯的提升。Munoz-Rojas 等[16]從分子生物學水平上證實菌體細胞膜中環(huán)丙烷型脂肪酸，在增強菌體冷凍干燥耐受性方面所發(fā)揮的重要作用。推測短乳桿菌49 環(huán)狀脂肪酸的增加在一定程度上對于酒花質量濃度的耐受性有著不可或缺的意義。此外，由表2可看出隨著酒花質量濃度的升高，平均鏈長呈上升趨勢，長鏈脂肪酸相較于0 mg/L的培養(yǎng)條件有較為顯著的變化。推測短乳桿菌49通過增加碳鏈長度使其更容易橫跨膜雙分子層，脂肪酸鏈排布更加緊密，有利于它的脂類和蛋白通過疏水作用結合，膜環(huán)境形成“凝膠狀”，膜的穩(wěn)定性也隨之增強，達到抵抗酒花滲入其內部環(huán)境的作用。Mykytczuk 等[17]、Fozo 等[18]也發(fā)現(xiàn)相似的結論，脂肪酸碳鏈長度的改變可以抵抗外界環(huán)境的脅迫。同時從表2中發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，短乳桿菌49 中脂肪酸更偏向于偶數(shù)脂肪酸，所占比例在80%左右，并隨著酒花質量濃度的升高，偶數(shù)脂肪酸所占比例也有所改變。

2.4 酒花對短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸飽和度、鏈分支的影響

細胞膜脂肪酸的組成對于維持細胞正常生長、代謝及內環(huán)境的穩(wěn)定有著不可或缺的作用。為了進一步探索酒花對短乳桿菌49 細胞膜組成的影響，對其細胞膜脂肪酸的飽和度、鏈分支進行研究（表3）。從表3可看出飽和脂肪酸是短乳桿菌49 的主要成分，占84%。隨著酒花質量濃度的升高，飽和脂肪酸所占比例下降，不飽和脂肪酸所占比例升高，結合表1發(fā)現(xiàn)主要是C20與C18這2 種飽和脂肪酸增長幅度較大。已有研究[19]表明，膜脂不飽和度的增加有利于維持細胞結構的穩(wěn)定性，且不飽和度決定了細胞膜的厚度和黏度，進而提高對環(huán)境脅迫的適應性。Jin 等[20]、田豐偉等[21]在干酪乳桿菌與植物乳桿菌中均發(fā)現(xiàn)酸脅迫會引起細胞膜脂肪酸不飽和度增加；方彥等[22]發(fā)現(xiàn)膜脂中不飽和脂肪酸含量的增加，能降低膜脂的相變溫度，使膜脂在低溫下保持穩(wěn)定。短乳桿菌49 通過調節(jié)不飽和脂肪酸的比例來保持細胞膜的正常生理功能，對提高酒花脅迫具有重要意義。細胞膜中的直鏈脂肪酸與支鏈脂肪酸與細胞膜的硬度有關[23]。從表3中發(fā)現(xiàn)隨著酒花質量濃度的升高，直鏈脂肪酸增加，由于直鏈脂肪酸的溶解度較支鏈脂肪酸高，因此短乳桿菌49 沒有通過增加直鏈脂肪酸增強細胞膜的堅硬度來對應酒花脅迫。而支鏈脂肪酸比例的增加可以抵抗冷脅迫環(huán)境[24]，推測短乳桿菌49 可以通過形成支鏈來適應酒花環(huán)境脅迫。飽和直鏈隨著酒花含量的增加逐漸降低，膜不飽和脂肪酸直鏈含量逐漸增加。Fozo 等[25]發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸的形成對于保持胞內外的pH 梯度具有重要作用，而酒花苦味酸正是通過破壞影響質子移動勢（Proton motive force，PMF）的pH 梯度，造成細胞無法正常進行營養(yǎng)轉運及代謝，使微生物的生長被抑制。短乳桿菌49 通過膜不飽和脂肪酸的增加來維持其胞內外質子移動勢，使其在高濃度酒花中生長。

表1 不同酒花質量濃度下短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸組分Table 1 The composition of fatty acids of Lactobacillus brevis 49 cell membrane with different mass concentration of hops

表2 不同酒花質量濃度下短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸平均鏈長、中長鏈、脂肪酸奇偶性所占比例Table 2 The proportion of average chain length，medium and long chain，and fatty acid parity of Lactobacillus brevis 49 cell membrane with different mass concentration of hops

表3 不同酒花質量濃度下短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸飽和度及鏈分支所占比例Table 3 The distribution of desaturation and branched fatty acids of Lactobacillus brevis 49 cell membrane with different concentration of hops

2.5 酒花對短乳桿菌49 細胞膜脂肪酸流動指數(shù)（U/S）的影響

前人的研究結果表明，脂肪酸的流動指數(shù)（U/S）可以作為環(huán)境脅迫的指標[26]。由圖4可看出0 mg/L 時，U/S 的數(shù)值為0.19，質量濃度為60 mg/L時，U/S 達到0.27，其細胞膜的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值（U/S）較出發(fā)菌株提高42.11%。U/S 值越大細胞膜流動性越強，說明短乳桿菌49在酒花脅迫下，細胞膜流動性隨其濃度升高而變強。Béal 等[27]提出增加菌體細胞膜U/S 比例，有利于乳酸菌適應冷脅迫。細胞膜的物化特性隨著外界環(huán)境的變化而發(fā)生改變，短乳桿菌49 細胞膜流動性的增強誘導膜上脅迫蛋白，如現(xiàn)在廣泛被認可具有抗酒花特性的HorA、HorB 和HorC 蛋白大量表達，增加了細胞膜中蛋白與磷脂的比例，從而降低酒花苦味酸進入細胞質膜的流速，穩(wěn)定菌體自身的正常生理代謝。

3 結論

圖4 酒花對短乳桿菌49 流動指數(shù)（U/S）Fig.4 Effect of hops on the U/S of Lactobacillus brevis 49 cells

短乳桿菌49 在含有酒花的MRS 培養(yǎng)基中可以生長，當酒花質量濃度高于60 mg/L 時被抑制生長。短乳桿菌49 胞外pH 值呈下降趨勢，這與其產酸以及酒花轉運蛋白和H-ATPase 酶將苦味酸及質子泵出胞外有關。高濃度的酒花會導致pH值升高。酒花對胞內ATP 的影響較大，酒花脅迫下的短乳桿菌49 胞內ATP 相較于無酒花脅迫低1 個數(shù)量級。胞內ATP 的大量消耗使細胞膜上相關蛋白及酶更好地維持胞內外pH 梯度。對細胞膜脂肪酸的檢測表明：隨著酒花質量濃度的升高，短乳桿菌49 中鏈脂肪酸減少，長鏈脂肪酸比例升高且平均鏈長也有提升。其中C19尤其是C19環(huán)狀脂肪酸與C20脂肪酸的增長最為明顯。對細胞膜脂肪酸飽和度、鏈分支和流動性的研究結果表明，酒花脅迫導致細胞膜不飽和脂肪酸與支鏈脂肪酸的增加，細胞膜流動性（U/S）有所上升。