恩替卡韋對(duì)rtA181V/T突變的慢性乙型肝炎患者的抗病毒效果觀察

李淑芹，周 靜，高 遠(yuǎn)，馬曉燕，汪莉萍

徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染性疾病科，江蘇 徐州 221002

慢性乙型肝炎(CHB)是全球性的公共健康問題，可引起嚴(yán)重的肝臟疾病，包括肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有2.5億人感染HBV[1]。在CHB患者中，高水平的HBV DNA復(fù)制增加肝硬化及肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，通過抗病毒治療將HBV DNA載量降至非常低或無法檢測(cè)的水平，可以延緩和減少疾病進(jìn)展以及降低死亡率[2-4]。目前，包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韋酯(ADV)、恩替卡韋(ETV)、替諾福韋(TDF)、丙酚替諾福韋(TAF)在內(nèi)的核苷(酸)類似物(NAs)被批準(zhǔn)用于抗HBV來預(yù)防肝臟疾病的進(jìn)展。但由于cccDNA的半衰期較長(zhǎng)，CHB患者需長(zhǎng)期口服NAs來抑制病毒的復(fù)制，而長(zhǎng)時(shí)間NAs治療會(huì)導(dǎo)致HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcription，RT)區(qū)發(fā)生耐藥突變的風(fēng)險(xiǎn)增加，最終影響抗病毒治療效果。

目前主要的耐藥模式(通路)有L型核苷耐藥模式(LAM、LdT)、無環(huán)磷酸鹽耐藥模式(ADV、TDF)、共享耐藥模式(ETV)、雙重耐藥模式及ETV初治耐藥模式5種[5-6]。而HBV RT181位點(diǎn)發(fā)生的氨基酸改變屬于多藥耐藥，會(huì)同時(shí)影響L型核苷耐藥模式和無環(huán)磷酸鹽耐藥模式，從而對(duì)LAM、ADV、LdT、TDF的藥物敏感性呈不同程度的下降[6]。此外，體外研究[7]顯示，rtA181V/T變異會(huì)影響病毒的復(fù)制，使HBsAg的分泌減少，具有潛在的致癌性[8]。研究[9]還發(fā)現(xiàn)181位點(diǎn)變異聯(lián)合其他變異后的耐藥性較其單獨(dú)變異的耐藥性增加。歐洲肝病學(xué)會(huì)指南[10]指出，ETV可作為rtA181V/T的挽救治療。對(duì)此，本研究通過回顧性分析研究ETV對(duì)rtA181V/T突變的CHB患者的抗病毒治療效果。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年1月—2017年1月就診于本院門診及住院部，進(jìn)行HBV基因耐藥變異檢測(cè)，并排除存在對(duì)ETV耐藥變異的CHB患者(rtTl84A/G/I/S、rtS202G/I、rtM2041/V/S、rtM250V/L、rtL180M、rtM250V/L、rtV173L)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18歲以上，HBsAg持續(xù)陽性≥6個(gè)月；(2)所有病例診斷均參照《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他嗜肝病毒感染、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、藥物性肝損傷及遺傳代謝性肝病等；(2)既往使用PEG-IFN治療的患者；(3)不符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]及資料不全的患者。

1.2 治療方法 所有患者均予以ETV(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100019)口服，0.5 mg，1次/d。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 檢測(cè)儀器與設(shè)備 (1)血清HBV DNA檢測(cè)：采用美國ABI公司生產(chǎn)的 ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，檢測(cè)下限為500 IU/ml。(2)血清HBeAg及HBsAg檢測(cè)：采用美國Abbott I2000全自動(dòng)微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀定量檢測(cè)。HBsAg檢測(cè)范圍為0.05～250 IU/ml，>250 IU/ml時(shí)采用1∶500自動(dòng)稀釋檢測(cè)，HBeAg檢測(cè)下限為0.50 PEIU/ml，<0.50 PEIU/ml定義為 HBeAg陰性。(3)采用Beckman Coulter AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、TBil。(4)HBV基因耐藥檢測(cè)：采用ABI基因測(cè)序儀3130對(duì)HBV DNA>1.0×103拷貝/ml的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，定量檢測(cè)HBV的P基因區(qū)有關(guān)于LAM、LdT、ADV、ETV、TDF的耐藥位點(diǎn)。上述所有指標(biāo)均在本院感染科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.2 療效評(píng)估指標(biāo) 依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[12]，病毒學(xué)應(yīng)答是指治療過程中血清HBV DNA低于檢測(cè)下限。應(yīng)答不佳或部分病毒學(xué)應(yīng)答是指NAs抗病毒治療中依從性良好的患者，治療24周時(shí)HBV DNA較基線下降幅度<2 log10IU/ml，但仍然可以被檢測(cè)到。病毒學(xué)突破是指NAs抗病毒治療中依從性良好的患者，在未更改治療的情況下，HBV DNA水平比治療中最低點(diǎn)上升1個(gè)log值或一度陰轉(zhuǎn)后又轉(zhuǎn)為陽性，并在1個(gè)月后以相同試劑重復(fù)檢測(cè)加以確定，可有或無ALT升高。病毒學(xué)無應(yīng)答是指NAs治療依從性良好的患者，治療12周時(shí)HBV DNA較基線下降幅度<1 log10IU/ml或治療24周時(shí)HBV DNA較基線下降幅度<2 log10IU/ml。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：XYFY2020-KL214-01。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入符合入組條件的CHB患者155例，按照耐藥變異類型將患者分為3組，A組：無耐藥變異72例(均為初治的CHB患者)；B組：rtA181V/T變異45例；C組：rtA181V/T+rtN236T變異38例。其中，A組男47例，女25例；年齡30～66歲，平均(47.53±9.80)歲。B組男28例，女17例；年齡32～63歲，平均(46.27±9.57)歲。C組男20例，女18例；年齡30～64歲，平均(47.42±9.54)歲。3組比較，年齡、性別以及ALT、AST、TBil水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 患者既往用藥情況及耐藥變異模式 本研究共隨訪了102例發(fā)生包含rtA181V/T單一或多位點(diǎn)突變的經(jīng)治CHB患者，其中發(fā)生rtA181V/T突變者45例，包含rtA181V/T在內(nèi)的多位點(diǎn)突變者57例。同時(shí)對(duì)于已納入的多耐藥位點(diǎn)患者，需排除已出現(xiàn)ETV耐藥位點(diǎn)的病例(表2)，最后符合條件的共38例，均為rtA181V/T+rtN236T變異。根據(jù)患者既往臨床NAs用藥史可知，有76例曾服用兩種及以上NAs抗病毒治療，其中47例出現(xiàn)多位點(diǎn)耐藥(61.84%)，既往單藥NAs抗病毒治療的26例患者中，10例出現(xiàn)多位點(diǎn)耐藥(38.5%)，2組患者多位點(diǎn)耐藥人數(shù)經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.295，P=0.038),表明用藥模式影響耐藥位點(diǎn)的發(fā)生，既往服用多種NAs的患者，更容易出現(xiàn)多位點(diǎn)突變和多重耐藥的可能。

表2 102例慢性HBV感染者既往用藥情況及耐藥變異模式

2.3 基線特征 對(duì)于B、C 2組患者來說，其初始服用NAs治療時(shí)基線HBV DNA水平[(7.08±1.59)、(6.94±1.61)log10IU/ml]比發(fā)生181位點(diǎn)突變時(shí)的HBV DNA基線水平[(6.22±1.48)、(5.94±1.45)log10IU/ml]較高(t=3.098，P=0.002；t=2.850，P=0.004)。當(dāng)經(jīng)治CHB患者出現(xiàn)rtA181V/T相關(guān)耐藥時(shí)，平均HBV DNA水平超過4 log10IU/ml。3組患者HBV DNA、HBsAg、HBeAg比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 ETV挽救治療時(shí)3組患者相關(guān)基線特征

2.4 3組病毒學(xué)應(yīng)答、生化學(xué)反應(yīng)的比較 隨訪至48周，ETV挽救治療無1例患者出現(xiàn)病毒學(xué)無應(yīng)答的情況，提示ETV對(duì)于發(fā)生rtA181位點(diǎn)耐藥變異挽救治療具有良好的效果。在ETV挽救治療24周時(shí)，A、B、C 3組分別有50、31和28例達(dá)到病毒學(xué)完全應(yīng)答水平，但HBV DNA陰轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24周時(shí)3組HBeAg陰轉(zhuǎn)情況分別為3例(4.2%)、1例(2.2%)、2例(5.3%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療48周3組HBV DNA陰轉(zhuǎn)率、HBeAg陰轉(zhuǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。ETV挽救治療24周及48周后3組患者的ALT、AST及TBil均下降，但3組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

2.5 影響ETV挽救治療效果的單因素及多因素分析 根據(jù)是否出現(xiàn)HBV DNA低于檢測(cè)下限為準(zhǔn)，將治療48周后的患者分為有效和無效組進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。單因素分析顯示，HBV DNA水平和HBeAg滴度對(duì)治療后病毒學(xué)應(yīng)答有影響(P值均<0.05)(表4)。多因素分析則提示HBV DNA水平是影響治療效果的危險(xiǎn)因素(OR=1.655，95%CI：1.128～2.428，P=0.01)。

表4 ETV挽救治療期間病毒學(xué)反應(yīng)預(yù)測(cè)的單因素分析

3 討論

由于初期我國經(jīng)濟(jì)條件不足，低效、高耐藥的NAs如LAM、ADV等被廣泛用于臨床中，加之醫(yī)務(wù)人員對(duì)耐藥問題認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)已成為NAs抗病毒治療中越來越嚴(yán)峻的問題。HBV對(duì)NAs的耐藥變異往往發(fā)生在HBV RT區(qū)，而不同位點(diǎn)突變的情況則是由所服用的NAs所決定、所誘導(dǎo)。181位點(diǎn)變異最早是Yeh等[13]在研究LAM耐藥中發(fā)現(xiàn)的，而根據(jù)HBV耐藥模式通路[6]可知，181位點(diǎn)變異是交叉核苷和核苷酸兩大類抗病毒藥物的共同耐藥位點(diǎn)，會(huì)影響大部分的NAs抗病毒治療效果，包括LAM、ADV、LdT、TDF。Villet等[14]的體外研究結(jié)果顯示，rtA181V/T突變降低了對(duì)LAM(10倍)、ADV(2～8倍)和TDF(2～3倍)的敏感性。本研究共納入102例發(fā)生rtA181位點(diǎn)突變的經(jīng)治CHB患者，結(jié)果顯示既往曾服用多種NAs抗病毒治療的患者更容易出現(xiàn)多位點(diǎn)耐藥變異。據(jù)報(bào)道[15]在歐美韓日等發(fā)達(dá)地區(qū)，有80%～90%的初治CHB患者選用高效、低耐藥的NAs治療，而我國高達(dá)81%的初治CHB患者因經(jīng)濟(jì)等原因而選用了低效、高耐藥的NAs。并且隨著人們對(duì)耐藥的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)了部分患者即使未使用任何NAs抗病毒治療，也會(huì)出現(xiàn)相關(guān)耐藥位點(diǎn)的預(yù)存耐藥現(xiàn)象[16]。因此對(duì)于CHB患者而言，初始抗病毒治療宜選用高耐藥基因屏障的一線藥物，如ETV、TDF或者TAF。對(duì)于已經(jīng)選用二線抗病毒藥物的患者，在沒有發(fā)生耐藥變異前建議盡早換用一線抗病毒藥物；已經(jīng)發(fā)生病毒學(xué)突破或應(yīng)答不佳的情況，建議予以基因耐藥檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果選擇敏感的一線藥物，或者聯(lián)合用藥，以減少耐藥變異的發(fā)生。

rtA181位點(diǎn)突變是近年來耐藥變異研究的重點(diǎn)。該位點(diǎn)突變主要與LAM、ADV有關(guān)，但在目前幾乎所有的NAs治療中都可以檢測(cè)到rtA181V/T突變位點(diǎn)，包括具有高耐藥屏障的TDF，甚至部分發(fā)生預(yù)存耐藥的患者也能檢測(cè)出rtA181V/T突變。另外由于HBV基因組中S區(qū)完全重疊于RT區(qū)，當(dāng)RT區(qū)某些堿基發(fā)生突變時(shí)，S區(qū)的改變也就相應(yīng)而生。其中發(fā)生rtA181T突變，會(huì)引起S區(qū)第172位氨基酸突變成終止密碼子，從而生成了截?cái)嗟腟蛋白，記作rtA181T/sW172*，而研究[13,17]表明，該截?cái)嗟鞍讜?huì)影響病毒的復(fù)制、HBsAg的分泌及具有潛在的致癌性。因此，本回顧性研究追蹤了發(fā)生耐藥變異的患者初始服用NAs治療的基線水平，結(jié)果與姬粉芝等[18]的論文結(jié)果一致：發(fā)生rtA181V/T突變位點(diǎn)的患者其HBV DNA基線水平較服用NAs治療基線時(shí)HBV DNA基線水平有所下降。

ETV屬于一線抗HBV藥物，能快速抑制病毒復(fù)制、改善肝纖維化，并且具有很低的耐藥率[19]。歐洲肝病學(xué)會(huì)指南[10]建議ETV可作為發(fā)生rtA181V/T變異的CHB患者的挽救治療。中國學(xué)者姬粉芝等[18]在一項(xiàng)回顧性研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)于發(fā)生rtA181位點(diǎn)變異的經(jīng)治CHB患者，ETV單藥的效果要明顯優(yōu)于LdT。韓登高等[20]研究顯示，ETV單用與聯(lián)合ADV治療rtA181V/T突變的患者在病毒學(xué)及生化學(xué)指標(biāo)上均無顯著差異，而本研究選用ETV挽救治療后，3組患者治療后的HBV DNA水平明顯下降，截止至隨訪結(jié)束，大部分患者都達(dá)到了病毒學(xué)完全應(yīng)答，且3組之間HBV DNA陰轉(zhuǎn)率、HBeAg陰轉(zhuǎn)率比較無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALT、AST、TBil復(fù)常率之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且未出現(xiàn)病毒學(xué)突破或病毒無應(yīng)答現(xiàn)象，說明ETV對(duì)rtA181位點(diǎn)突變有很好的挽救治療效果。但是作者觀察到無耐藥變異組24、48周HBV DNA陰轉(zhuǎn)率與Luo等[21]研究結(jié)果(69.4% vs 85.0%、83.3% vs 89.4%)存在差異?？紤]到以下方面的原因：第一，多項(xiàng)研究結(jié)果表明HBV DNA高載量、HBeAg陽性、ALT低水平等影響ETV治療初治CHB患者的病毒學(xué)應(yīng)答[21-22]，本文中無耐藥變異組所納入的CHB患者HBeAg均為陽性，相較于Luo等研究中的HBeAg陽性率(113/230)較高。其次，盡管在ETV治療之前已對(duì)無耐藥變異組進(jìn)行基因耐藥變異檢測(cè)，但由于檢測(cè)技術(shù)有限而有可能出現(xiàn)漏檢情況。因此，對(duì)于初治CHB患者，服用ETV治療1年后仍有持續(xù)低病毒血癥，臨床上要如何處理？Luo等[21]的研究中對(duì)于這類患者繼續(xù)給予ETV單藥治療，結(jié)果顯示在144、192周HBV DNA陰轉(zhuǎn)率均為100%。因此，在臨床中對(duì)于治療1年仍表現(xiàn)持續(xù)低病毒血癥的初治CHB患者可以暫時(shí)不予以調(diào)整抗病毒藥物，但需要?jiǎng)討B(tài)觀察HBV DNA水平，如果有持續(xù)下降之勢(shì)，則可以繼續(xù)應(yīng)用;如果HBV DNA在繼續(xù)ETV抗病毒治療過程中處于平臺(tái)期，則需及時(shí)調(diào)整抗病毒方案，可以換用TDF或TAF，也可以選擇聯(lián)合用藥。

若患者服用ETV后再次出現(xiàn)應(yīng)答不佳或耐藥，該如何治療？Lim等[23]經(jīng)過96周的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)TDF單藥組與ETV聯(lián)合TDF組在病毒學(xué)、生化學(xué)及血清學(xué)應(yīng)答上無顯著差異。其他的研究[22,24]也表明TDF單藥治療對(duì)LAM、ADV及ETV耐藥的患者是有效的。但國外的一項(xiàng)隊(duì)列研究[25]顯示，與初治的CHB患者相比，TDF單藥治療對(duì)ADV耐藥患者的療效較低，尤其是對(duì)LAM、ADV均耐藥的患者。且2019年版更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[11]也建議：對(duì)于出現(xiàn)LAM、ADV及ETV的多重耐藥，建議ETV聯(lián)合TDF/TAF治療。因此，對(duì)于多重耐藥CHB患者，建議選擇聯(lián)合抗病毒治療。

Li等[26]研究報(bào)道，HBV DNA水平可以預(yù)測(cè)ETV挽救治療的治療效果。本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)HBV DNA水平及HBeAg滴度影響ETV抗病毒療效，但多因素分析提示初始治療時(shí)HBV DNA水平是ETV抗病毒治療48周效果的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

綜上，本研究探討ETV挽救治療rtA181V/T變異及rtA181V/T+rtN236T變異患者的療效，結(jié)果表明ETV挽救治療效果較好，而基線HBV DNA水平是治療48周時(shí)抗病毒效果的唯一預(yù)測(cè)因子。但本研究仍存在一定的局限性。首先，該設(shè)計(jì)是回顧性的，為了克服由此產(chǎn)生的選擇偏差，本研究采用嚴(yán)格的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，并試圖延長(zhǎng)觀察期。其次，1年的調(diào)查可能不足以觀察抗病毒藥物的長(zhǎng)期療效。第三，納入患者數(shù)量相對(duì)不足(n=155)，隨訪時(shí)間較短，因此需要更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪來評(píng)估ETV挽救治療rtA181V/T突變患者的長(zhǎng)期療效，以及觀察該位點(diǎn)耐藥變異后疾病進(jìn)展情況和腫瘤發(fā)生情況等。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：李淑芹負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；周靜、高遠(yuǎn)、馬曉燕參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；汪莉萍負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。