屈鳳祥， 常 紅， 林 毅， 王 芳， 王加蘭

青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，青島 266000

過(guò)敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura, HSP)是一種常發(fā)生于兒童的小血管炎，可導(dǎo)致各種臨床癥狀，如皮膚紫癜、關(guān)節(jié)炎和(或)關(guān)節(jié)痛、腹痛和腎臟受累表現(xiàn)。其中，20%～55%的過(guò)敏性紫癜患兒會(huì)發(fā)生腎臟損害[1]，部分腎損害可進(jìn)展為腎功能不全，導(dǎo)致患兒不良遠(yuǎn)期預(yù)后。目前，HSP的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，但其病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。

細(xì)胞因子參與維持人體免疫系統(tǒng)促炎和抗炎功能的動(dòng)態(tài)平衡[2]。首先促炎因子促進(jìn)自身免疫性炎癥的啟動(dòng)和擴(kuò)散，隨后抗炎因子促進(jìn)炎癥消退和急性期恢復(fù)，并誘導(dǎo)自身抗體聚集[3]。白細(xì)胞介素-1(IL-1)是一種典型的促炎細(xì)胞因子，其中IL-Iβ是內(nèi)皮細(xì)胞以自分泌方式表達(dá)IL-1的重要刺激因子。T細(xì)胞中的IL-1β可誘導(dǎo)顯著而持久的一級(jí)和二級(jí)CD4反應(yīng)[4]。

HSP具有家族聚集性，即遺傳因素可能在其發(fā)病過(guò)程中起重要作用[5]。B淋巴細(xì)胞多克隆活化為HSP特征，而IL-1β參與刺激B細(xì)胞增殖和分化，由此推測(cè)IL-1β功能異常可能參與HSP的發(fā)生。rs1143627可能影響IL-1β轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)功能，通過(guò)降低細(xì)胞因子IL-1Ra的拮抗特性而影響IL-1β水平[6]。因此，本研究對(duì)IL-1β基因rs1143627位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與HSP及紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis, HSPN)的相關(guān)性進(jìn)行探討，以期為HSPN的個(gè)性化治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年1月至2019年12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的174例HSP患兒作為病例組。所有患兒均符合2006年EULAR/PReS制定的兒童血管炎分類標(biāo)準(zhǔn)，至少隨訪6個(gè)月。所有參與者均通過(guò)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查篩查，排除免疫性血小板減少性紫癜、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥、其他腎臟疾病和外科急腹癥等疾病。本研究方案由青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得家屬知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) HSP診斷參考EULAR/PReS 2006年制定的兒童血管炎分類標(biāo)準(zhǔn)[7]，即可觸性(必要條件)皮疹伴以下任意1條：(1)彌漫性腹痛；(2)任何部位活檢示IgA沉積；(3)關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)痛；(4)腎臟受損表現(xiàn)[血尿和(或)蛋白尿]。HSPN的診斷及腎臟病理分級(jí)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組2009年制定的診治循證指南[8]：在HSP 6個(gè)月病程內(nèi)，出現(xiàn)血尿和(或)蛋白尿。

1.3 分 組 根據(jù)臨床癥狀將病例組分為單純型組(僅表現(xiàn)為皮膚紫癜)、關(guān)節(jié)型組(皮膚紫癜合并關(guān)節(jié)癥狀)、腹型組(皮膚紫癜合并消化道癥狀)、混合型組(皮膚紫癜合并關(guān)節(jié)癥狀，同時(shí)伴有消化道癥狀)；根據(jù)隨訪過(guò)程中是否發(fā)生HSPN分為非HSPN組、HSPN組。另選擇162名于我院體檢的年齡匹配的健康兒童作為對(duì)照組。

1.4 IL-1β基因rs1143627位點(diǎn)檢測(cè)及測(cè)序

1.4.1 標(biāo)本收集及DNA提取 清晨抽取患者空腹外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用天根生化科?北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer 3軟件針對(duì)目的基因全長(zhǎng)進(jìn)行特異性多重引物設(shè)計(jì)(表1)。引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 rs1143627引物序列表

1.4.3 多重PCR擴(kuò)增目的基因及測(cè)序 PCR反應(yīng)擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃延伸5 min，共30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，采用3%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物上樣5 μL(圖1)，根據(jù)多重PCR重?cái)?shù)確定稀釋小試樣本數(shù)，進(jìn)行qPCR檢測(cè)(圖2)。通過(guò)雙端barcode原理區(qū)分不同樣本并混樣建庫(kù)后，在Illumina X-10平臺(tái)測(cè)序。

呼吸困難是急性期中重度COPD患者常見(jiàn)的臨床癥狀，是患者病情復(fù)發(fā)住院的主要誘發(fā)因素之一[5]。而肺康復(fù)治療的主要觀察指標(biāo)是患者的呼吸困難癥狀是否獲得有效改善[6]。通過(guò)呼吸及功能鍛煉能較快經(jīng)鼻深吸氣，且能讓肋間外肌、膈肌等吸氣肌參與到整個(gè)吸氣過(guò)程中，使進(jìn)入肺中的氣量盡可能多，能有效防止氣道過(guò)早的陷閉，吸氣后再緩慢地縮唇呼氣，延長(zhǎng)呼氣時(shí)間，以減少呼氣末期肺內(nèi)潴留的二氧化碳含量，利于氣體交換，從而有效改善患者呼吸困難癥狀[7]。

圖1 部分DNA樣品PCR電泳結(jié)果

圖2 qPCR結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 HSP患兒臨床病理特點(diǎn) 174例HSP患兒中，單純型40例、關(guān)節(jié)型77例、腹型24例、混合型33例，均在門診接受了至少6個(gè)月的隨訪，平均隨訪(9.1±2.7)個(gè)月。隨訪結(jié)果顯示104例HSP患兒完全緩解(尿檢無(wú)異常，非HSPN組)，70例患兒表現(xiàn)為持續(xù)腎臟損傷(HSPN組)。HSPN組70例患兒中孤立性血尿28例(40.0%)、孤立性蛋白尿22例(31.4%)、血尿合并蛋白尿20例(28.6%)。HSPN組70例患兒中12例行腎臟穿刺活檢，病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)2例，Ⅱa級(jí)2例，Ⅲa級(jí)3例，Ⅲb級(jí)3例，Ⅳa級(jí)1例，Ⅳb級(jí)1例。病例組與對(duì)照組、非HSPN組與HSPN組間研究對(duì)象年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 病例組與對(duì)照組研究對(duì)象年齡性別比較

2.2 病例組與對(duì)照組rs1143627基因型和等位基因頻率的比較 rs1143627基因型頻率與等位基因在病例組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。等位基因G(OR=0.671，95%CI 0.494～0.911)可能是HSP發(fā)病的危險(xiǎn)因素

表3 病例組與對(duì)照組中rs1143627基因型和等位基因比較 n(%)

2.3 病例組中各臨床癥狀亞組rs1143627基因型和等位基因頻率比較 rs1143627基因型頻率與等位基因在HSP不同臨床癥狀分組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

2.4 病例組中非HSPN組與HSPN組基因型和等位基因頻率的比較 rs1143627基因型與等位基因在非HSPN組與HSPN組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表5)。等位基因G(OR=1.731,95%CI 1.123～2.669)可能是HSPN發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

2.5 Hardy-Weinberg平衡定律檢測(cè) Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示：rs1143627基因座的基因型與HSPN表型具有相關(guān)性(χ2=0.028，P=0.866)，表明該位點(diǎn)具有HSPN群體代表性。

3 討 論

HSP是兒童最常見(jiàn)的系統(tǒng)性血管炎，在4～6歲兒童中發(fā)生率最高[9]。HSP患兒多可自行緩解，預(yù)后佳。然而，部分患兒可累及腎臟，并發(fā)展為慢性腎臟病。目前HSP的病因與發(fā)生機(jī)制尚不明確。在HSP急性期，血清IgA濃度升高，IL-2、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α (TNF-α)異常表達(dá)[5,10]，提示該病為免疫介導(dǎo)性疾病?；虍惓?huì)影響細(xì)胞因子的表達(dá)，單核苷酸多態(tài)性改變可能影響對(duì)應(yīng)細(xì)胞因子的功能。

表4 病例組各臨床癥狀亞組中rs1143627基因型和等位基因比較 n(%)

表5 非HSPN組與HSPN組中rs1143627位點(diǎn)基因型和等位基因比較 n(%)

系統(tǒng)性血管炎性疾病(如HSP)患者各器官組織的慢性炎癥反應(yīng)常由TNF-α、IL-6和IL-1β等多種細(xì)胞因子異常高表達(dá)引發(fā)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、2型糖尿病、川崎病等炎癥性疾病[12-15]的易感性與IL-1β基因多態(tài)性的關(guān)系得到了證明。此外，一項(xiàng)研究在IL-1β缺陷小鼠模型(IL-1β-/-和IL-1α/β-/-)中發(fā)現(xiàn)，IL-1β介導(dǎo)的免疫刺激和炎癥反應(yīng)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，病例組IL-1β rs1143627位點(diǎn)GG基因型頻率增加(P=0.016)，且等位基因G頻率增加(P=0.010)，故推測(cè)等位基因G可能是HSP易感的危險(xiǎn)因素。

成熟的IL-1β基因能刺激環(huán)氧合酶2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因(NOS2A)等(炎癥和免疫相關(guān)基因的表達(dá))[11]。NOS2A能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，進(jìn)而釋放一氧化氮(NO)和大量細(xì)胞因子，影響白細(xì)胞游走、遷移以及黏附，并能影響?zhàn)じ揭蜃拥幕钚?，最終損傷血管壁、腎臟等組織。Martin等[17]發(fā)現(xiàn)，HSP患者和對(duì)照組NOS2A啟動(dòng)子等位基因和基因型頻率差異明顯，表明該基因在HSP易感性和腎炎發(fā)展中具有潛在作用。本研究顯示，非HSPN組rs1143627位點(diǎn)GG基因型頻率高于HSPN組(P=0.024)，且兩組等位基因G差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)，進(jìn)一步說(shuō)明rs1143627位點(diǎn)基因型GG與等位基因G可能是HSP的易感基因，且與HSPN的發(fā)生有關(guān)。

另外，一項(xiàng)檢測(cè)炎癥對(duì)脂質(zhì)代謝影響的研究[18]發(fā)現(xiàn)，IL-1β可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞中膽固醇酯積累，從而導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激?；钚匝醮x產(chǎn)物可引起多種病理破壞，包括系統(tǒng)性血管炎和腎臟疾病。HSP患者氧化應(yīng)激水平升高，脂質(zhì)過(guò)氧化可能在HSP發(fā)病和腎損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]。

本研究中，rs1143627位點(diǎn)基因型和等位基因在病例組臨床癥狀分型中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果可能與各分型樣本量較少有關(guān)，后期會(huì)通過(guò)加大樣本量繼續(xù)證實(shí)。同時(shí)，尚需在多中心、多地區(qū)、多民族人群中驗(yàn)證本研究結(jié)果。

綜上所述，IL-1β作為參與免疫反應(yīng)的重要因子，其基因多態(tài)性與HSP及腎損害密切相關(guān)，其rs1143627位點(diǎn)等位基因G可能是兒童HSP及腎臟損傷的危險(xiǎn)因素。該位點(diǎn)基因多態(tài)性可能通過(guò)影響基因調(diào)控導(dǎo)致患者血清細(xì)胞因子水平改變而致病。建立基因型與其表型之間的功能相關(guān)性模型是決定基因多態(tài)性臨床意義的關(guān)鍵，并能為患兒的個(gè)體化治療提供依據(jù)。