傳統(tǒng)方法與分子生物檢測(cè)結(jié)核病的比較研究

王茂全

摘要：目的：比較傳統(tǒng)方法與分子生物檢測(cè)結(jié)核病的有效性。方法：選擇2016年～2017年在醫(yī)院就診的疑似結(jié)核患者90例。檢測(cè)方法采用分子生物檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法，比較兩種方法的有效性。結(jié)果：傳統(tǒng)方法檢出率為62.2%，生物檢測(cè)方法檢出率為82.2%。傳統(tǒng)方法檢出率低于分子生物檢測(cè)法檢出率（P < 0.05） ，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩方法檢測(cè)陽(yáng)性符合率為75.6%。結(jié)論：在結(jié)核病檢測(cè)中，生物檢測(cè)方法比傳統(tǒng)方法有更多的優(yōu)點(diǎn)，例如較為方便、速度快、出錯(cuò)率低等，具有良好的診斷價(jià)值，適合臨床醫(yī)療在診療活動(dòng)中使用。

關(guān)鍵詞：傳統(tǒng)方法;分子生物檢測(cè)方法;結(jié)核病;比較

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌所引起的一類傳染性疾病，是由單一病原體傳染而引發(fā)的死亡數(shù)最多的疾病[1～2]。在2010年，我國(guó)進(jìn)行了一次結(jié)核病流行病學(xué)篩選，流調(diào)結(jié)果表明，我國(guó)每年有超過(guò)130萬(wàn)的結(jié)核病病人，在全世界的結(jié)核病患者中，占比約13.2%，位居全球第二[3～4]。經(jīng)過(guò)過(guò)去很長(zhǎng)時(shí)間的努力，我國(guó)結(jié)核病的發(fā)病率在一定程度上得到了控制，結(jié)核病的發(fā)病情況趨于平穩(wěn)。但最近這些年[5～6]，我國(guó)部分地區(qū)結(jié)核病再次增多，使得研究人員對(duì)此現(xiàn)象十分重視。結(jié)核病的初步預(yù)防很關(guān)鍵，重點(diǎn)依靠實(shí)驗(yàn)室診斷、結(jié)核病的鑒定、診療的實(shí)施。當(dāng)下結(jié)核病檢測(cè)方法需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，不符合臨床的實(shí)際需求，因此，必須研究一種新的方法[7]。文章選擇2016年～2017年來(lái)醫(yī)院就診的90例疑似患者，對(duì)傳統(tǒng)方法與分子生物檢測(cè)法進(jìn)行對(duì)比，對(duì)所獲得的結(jié)果進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 一般資料

本研究選擇2016年～2017年來(lái)醫(yī)院就診的90例疑似患者，其中男性占比5/9，女性占比4/9，所有患者的年齡30～73歲，年齡的均值與標(biāo)準(zhǔn)差分別是45.4歲、3.6歲，所有選定的患者都被告知本研究的科學(xué)目的，同時(shí)簽署了知情書(shū)。

1.2 方法

儀器：PCR儀器所采用的是宏石SLAN-96P。

標(biāo)本采集液：在采集到的痰液標(biāo)準(zhǔn)樣板中加入4%NaOH飽和溶液，加至4倍痰液體積，混勻，室溫放置30 min使其液化，取1 mL置于離心管中。離心機(jī)12000 rpm，離心5min，除去上清，沉淀后加入1 mL無(wú)菌試驗(yàn)生理鹽水，攪拌均勻，12000 rpm重復(fù)離心5 min，洗滌兩次[8～9]。沉淀后加入50 μDNA提取液，充分?jǐn)嚢璧玫斤柡腿芤褐械乃蝗苄猿煞?，采集過(guò)程中應(yīng)使用進(jìn)樣器充分混合均勻平衡[10]。如果移液器吸頭太細(xì)而無(wú)法消化吸收或堵塞吸頭，使用未受污染的吸頭將其從移液器吸頭頂部取出并切成塊，然后置于金屬浴中10 min，離心5 min，12000 rpm。

檢驗(yàn)方法：所有標(biāo)本均通過(guò)提取病原載玻片、抗酸染色光學(xué)顯微鏡和熒光定量PCR檢查采集。取一個(gè)PCR反應(yīng)管，插入已解析的質(zhì)量保險(xiǎn)單，8 000 rpm離心5秒，將反應(yīng)管置于PCR檢測(cè)器中，增加至93℃預(yù)旋2 min，然后93℃45 s，55℃120 s，30個(gè)循環(huán)后，置于33℃條件下;PCR反應(yīng)后檢測(cè)熒光，將PCR管充分冷藏至33℃，擴(kuò)增后的反應(yīng)管迅速放入熒光中，檢測(cè)儀讀取并記下數(shù)據(jù)，熒光激發(fā)波長(zhǎng)487 mm，檢測(cè)波長(zhǎng)525 mm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析軟件采用SPSS ，計(jì)量資料用均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比表示，兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

傳統(tǒng)方法檢測(cè)陽(yáng)性56例，檢出率62.2%;分子生物檢測(cè)方法檢測(cè)陽(yáng)性74例，檢出率82.2%。傳統(tǒng)方法陽(yáng)性檢出率低于分子生物學(xué)檢測(cè)方法（P < 0.05） ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2 = 8.792） 。兩方法檢測(cè)陽(yáng)性符合率為75.6%（56/74） ，見(jiàn)表1

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌所引起的，近年來(lái)流行率再次持續(xù)上升。結(jié)核病檢測(cè)是診斷結(jié)核病最特異的方法，痰涂片是肺結(jié)核患者診療、判斷、開(kāi)具治療計(jì)劃、評(píng)估治療結(jié)果的常用方式或方法。涂片抗酸染色迅速方便，同時(shí)因?yàn)榉堑湫头种U菌在中國(guó)基本上看不到，如果分枝桿菌出現(xiàn)陽(yáng)性，那么大體上能夠判斷結(jié)核病。樣品在體外聚合，采用鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 方法，擴(kuò)增出結(jié)核桿菌中所含的DNA，并通過(guò)電泳進(jìn)行檢測(cè)。該方法不用體外預(yù)培養(yǎng)，2d就可以獲得報(bào)告，節(jié)省時(shí)間并且很方便，可識(shí)別細(xì)菌種類，但不足之處是可能存在假陽(yáng)性或假陰性的情況。 PCR技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于臨床療效評(píng)價(jià)、傳染病控制和發(fā)病機(jī)制調(diào)查具有重要意義。因?yàn)楸唤Y(jié)核桿菌所感染后并不會(huì)出現(xiàn)任何顯著的癥狀，只是PPD檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性，所以結(jié)核病的判斷是臨床科研以及結(jié)核病預(yù)防的關(guān)鍵。過(guò)去，肺結(jié)核的臨床判斷大多數(shù)是按照就診病人的臨床體征，再加上相應(yīng)的檢測(cè)化驗(yàn)數(shù)據(jù)，但由于很多的就診病人并未存在明顯的癥狀，所以臨床診斷困難。實(shí)驗(yàn)室結(jié)核病的判斷大體上是以細(xì)菌涂片與痰培養(yǎng)為核心。痰涂片檢查法能夠判斷出結(jié)核病的傳染源，價(jià)格便宜，適合我國(guó)國(guó)情，然而檢測(cè)陽(yáng)性率不高，進(jìn)而使得對(duì)結(jié)核病的判斷不夠準(zhǔn)確。然而在當(dāng)下的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室測(cè)試中，痰培養(yǎng)診斷還是金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是針對(duì)藥敏檢測(cè)，在患者臨床用藥和耐藥性檢測(cè)等方面有著十分關(guān)鍵的價(jià)值，但檢測(cè)周期還是比較長(zhǎng)，所以需要進(jìn)行更新。

在治療結(jié)核病領(lǐng)域，生物技術(shù)逐漸獲得了廣泛的應(yīng)用，其中便包括PCR熒光技術(shù)的廣泛應(yīng)用 [11～15]。PCR技術(shù)采用結(jié)合分枝桿菌為非特異性引物、非特異性熒光探針、PCR反應(yīng)液、高溫DNA聚合酶、單四多肽鏈等成分，在體外擴(kuò)增的基礎(chǔ)上檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。

PCR技術(shù)在生物檢測(cè)法中的實(shí)施是在PCR反射中加入熒光功能基團(tuán)，檢測(cè)熒光數(shù)據(jù)信號(hào)的積累，檢測(cè)PCR的全過(guò)程，并對(duì)樣品中DNA確定的過(guò)程。測(cè)試結(jié)果在1d內(nèi)獲得[16～18]。PCR擴(kuò)增在封閉狀態(tài)下進(jìn)行，會(huì)降低環(huán)境的影響，減少陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，在檢測(cè)靈敏度上確定性很高[19]。

本研究獲取90份疑似患者痰標(biāo)本，采用傳統(tǒng)方法、生物檢測(cè)法分別進(jìn)行檢測(cè)，傳統(tǒng)方法痰涂片陽(yáng)性率為62.2%，生物檢測(cè)方法陽(yáng)性率為82.2%，兩種方法的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

總而言之，在結(jié)核病的檢測(cè)過(guò)程中，生物檢測(cè)方法比傳統(tǒng)方法有更多的優(yōu)點(diǎn)，例如較為方便、速度快、出錯(cuò)率低等，具有良好的診斷價(jià)值，適用于臨床醫(yī)學(xué)用途。但是，隨著對(duì)結(jié)核分枝桿菌的科學(xué)研究不斷增多，許多新的檢測(cè)方法層出不窮，雖然每一種檢測(cè)方法都有其自身的優(yōu)劣勢(shì)，而且部分新研究出來(lái)的檢測(cè)方法還未能在臨床上普及，甚至有一部分還在實(shí)驗(yàn)室階段，但是相信隨著我國(guó)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)以及生物科技的不斷進(jìn)步，研究探索從整體的角度進(jìn)行，從細(xì)菌水平到分子水平，從傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法到現(xiàn)代的實(shí)驗(yàn)室方法，并且在各個(gè)層次和深度上不斷進(jìn)化和完善，這樣就可以一個(gè)接一個(gè)地走進(jìn)醫(yī)院，以理想化的方式成功完成結(jié)核病的檢測(cè)[20～22]。作為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)人員，每個(gè)人都必須掌握新的專業(yè)知識(shí)和新技術(shù)應(yīng)用，尋找一種高精度、非特異性、高靈敏度、簡(jiǎn)便快捷的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)新方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Lawn SD，ZumLa AI.Tuberculosis[J].Lancet，2011，378（9785）：57-72.

[2]全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

[3]李強(qiáng)，夏輝，歐喜超，等.應(yīng)用線性探針技術(shù)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)耐藥結(jié)核病的成本比較[J].中國(guó)防癆雜志，2013，35（3）：187-190.

[4]趙琪林.三種檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值的比較研究[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2012，16（3）：85-86.

[5]李榮輝，羅又瑋.4種檢測(cè)方法在診斷結(jié)核病中的價(jià)值分析[J].臨床合理用藥雜志，2016，9（23）：96-98.

[6]馮玉敏.結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法學(xué)比較及進(jìn)展[J].中國(guó)城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2015，30（4）：29-31.

[7]王震，龔玉華，錢(qián)彩娣，等.5種結(jié)核桿菌檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（3）：334-336.

[8]張威，李國(guó)蘭，徐杰，等.3種結(jié)核病快速診斷新技術(shù)與傳統(tǒng)方法的對(duì)比分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，27（22）：3245-3247.

[9]梅早仙，韓駿鋒，吳琦.結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)新進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志，2015，35（8）：611-615.

[10]高孟秋，劉菲，紀(jì)濱英，等.兩種γ-干擾素釋放分析在結(jié)核病臨床診斷中的比較研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2012，35（10）：762-765.

[11]陳雪林，崔嘉，劉宇，等.兩種全血γ-干擾素釋放試驗(yàn)試劑盒在結(jié)核病診斷中的比較研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2013，6（24）：11380-11383.

[12]鮑磊，李濤，盧水華.全血γ干擾素釋放試驗(yàn)在兒童和成人中的結(jié)核病診斷價(jià)值[J].微生物與感染，2014，9（1）：21-27.

[13]陸宇.結(jié)核分枝桿菌活菌檢測(cè)方法及應(yīng)用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27（6）：423-426.

[14] Dye C，Williams BG.The population dynamics and control of tuber culosis[J].Science，2010，328（5980）：856-861.

[15] 中國(guó)防癆協(xié)會(huì)臨床專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病臨床診治進(jìn)展年度報(bào)告年（第一部分，結(jié)核病臨床診斷） [J].中國(guó)防癆雜志，2013，35（6）：405-424.

[16] Diya Lu，Cheng Chen，Shenglei Yu，et al.Diagnosis of tuberculous meningitis using a combination of peripheral blood T-SPOT.TB and cerebrospinal fluid Interferon-γ detection methods[J].Lab Med，2016，47（1）：6-2.

[17]葛均波，徐永健.內(nèi)科學(xué)[M].第8版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：66.

[18] 王海英，王仕昌，趙靜，等.結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)技術(shù)在學(xué)校結(jié)核密切接觸者中篩查潛伏結(jié)核感染的應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（ 9） ： 1030-1033

[19]張建武，魏存樂(lè)，吉煥英，等.結(jié)核PCR定量測(cè)定在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用[J]. 北方藥學(xué)，2013，10（10）：3.

[20]卞永娟.PCR技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2015（24）：117-117.

[21]梁斌.實(shí)時(shí)熒光PCR方法與痰涂片法檢測(cè)結(jié)核桿菌的價(jià)值分析[J].中國(guó)療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2020，29（7）：3.

[22]張少靜，翟振國(guó)，田清武，等.不同檢測(cè)手段對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值的比較[J].康復(fù)與療養(yǎng)雜志，1996（4）：156-158.