高壓均質(zhì)條件下大豆蛋白熱聚集體結構和乳化特性研究

郭增旺 郭亞男 李柏良 江連洲 王中江 劉 軍

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院, 哈爾濱 150030； 2.臨邑禹王植物蛋白有限公司， 德州 253000；3.克東禹王大豆蛋白食品有限公司, 齊齊哈爾 161000)

0 引言

大豆是我國主要農(nóng)作物之一。大豆富含蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸，其蛋白質(zhì)含量幾乎是肉、蛋、魚的2倍，是小麥、大米等谷類作物的2倍以上，質(zhì)量分數(shù)通常為40%～50%[1]。但大豆蛋白中含有脲酶和胰蛋白酶抑制劑等，為提高大豆產(chǎn)品的消化性，常采用特殊手段對其進行失活處理。熱處理技術可通過滅活蛋白酶抑制劑和促使蛋白質(zhì)變性來增強大豆蛋白的營養(yǎng)價值和功能活性[2]。在熱殺菌、噴霧干燥等加工過程中，蛋白質(zhì)極易受到溫度的影響而發(fā)生構象改變(即高級結構發(fā)生去折疊)、分子內(nèi)部疏水殘基逐漸暴露和表面巰基含量增高，在加熱作用和高離子強度下形成疏水鍵的氨基酸殘基從蛋白分子內(nèi)部轉移到了分子表面，促使蛋白質(zhì)通過化學作用力相互連接而逐漸聚集。蛋白組分的聚集程度決定了蛋白的某些生物和功能特性，如蛋白的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性等[3]。研究表明，熱處理對大豆蛋白營養(yǎng)和功能活性的影響程度受蛋白質(zhì)聚集程度和聚集形態(tài)的影響[4]。為此，國內(nèi)外學者在蛋白熱誘導聚集領域進行了大量的研究[5-8]，探究熱誘導聚集對蛋白功能性質(zhì)的影響，并通過一定的手段改變熱處理后的蛋白質(zhì)變性和聚集程度，進而實現(xiàn)物理場對熱聚集體的改性作用機理。

高壓均質(zhì)(High-pressure homogenization, HPH)加工處理具有高壓力和高剪切應力、高速湍流、空化效應等作用，通過該處理影響和改變蛋白間的相互作用力，打破分子間化學鍵，改變蛋白的空間構象，進而實現(xiàn)對蛋白的結構和功能特性的改性處理[9]。文獻[10]研究表明，高壓均質(zhì)可以通過改變蛋白聚集體的形態(tài)改善乳清蛋白的起泡特性。文獻[11]研究了不同壓強下高壓均質(zhì)對乳清蛋白乳化特性的影響，發(fā)現(xiàn)160 MPa的高壓均質(zhì)處理能降低乳清蛋白的乳化活性。這些研究均表明，高壓均質(zhì)處理工藝能通過改變蛋白的聚集結構和分子構象來改變其功能特性。但是，目前關于高壓均質(zhì)與熱聚集體的結構和功能活性之間的關系，尤其是HPH對大豆蛋白熱聚集體(HSPIs)的影響卻鮮有報道。

為了探討高壓均質(zhì)處理對大豆蛋白熱聚集體結構和功能特性的影響，本文采用加熱方法誘導生成大豆蛋白可溶性熱聚集體，采用高壓均質(zhì)技術作用于蛋白聚集體，進而探討高壓均質(zhì)(30、60、90、120 MPa)處理對大豆蛋白熱聚集體結構和功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPIs，純度94.2%)，山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司；8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，上海將來實業(yè)股份有限公司；磷酸鹽緩沖溶液、十二烷基硫酸鈉(SDS)，索萊寶生物科技有限公司；一級大豆油，九三糧油工業(yè)集團有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

AVP-2000型高壓均質(zhì)儀，英國Stansted Fluid Power公司；Zetasizer Nano ZSP型納米粒度電位儀，馬爾文儀器公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司； MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司; Bohlin Gemini 2型旋轉流變儀，英國Malvern公司；ALPHA1-4LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司。

1.3 樣品制備

將SPIs溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中(pH值7.2、含NaN3質(zhì)量濃度0.5 mg/mL)，配成10 mg/mL的SPIs溶液后，置于100℃恒溫水浴鍋中20 min，誘導生成大豆蛋白熱聚集體(HSPIs)，迅速冰浴，冷卻備用。分別采用壓力為0、30、60、90、120 MPa的高壓均質(zhì)處理大豆蛋白熱聚集體1個循環(huán)后，9 000 r/min低溫離心20 min，取上清液凍干，制得實驗樣品，其與未經(jīng)高壓均質(zhì)處理的SPIs分別記為SPIs、HSPIs、HSPIs-30、HSPIs-60、HSPIs-90、HSPIs-120。

1.4 指標測定

1.4.1粒徑分布測定

將樣品配制成0.05 g/mL的溶液，磁力攪拌10 min后加入測量池中，參數(shù)設定為：顆粒折射率1.460、分散劑折射率1.330，采用納米粒徑電位儀測定其粒徑分布特征和蛋白質(zhì)分散指數(shù)。

1.4.2濁度測定

參照文獻[12]的方法,并略加改動。將各組樣品采用磷酸鹽緩沖溶液配制成所需的蛋白濃度后，磁力攪拌60 min，采用熒光光度計測定600 nm波長下的吸光度A，濁度計算公式為

(1)

式中V——稀釋倍數(shù)

I——光程，取0.001 m

1.4.3蛋白骨架結構成像

參照文獻[11]的方法，并略加改動。取一滴樣品滴于銅網(wǎng)格上固定，待吸附后反復沖洗并取0.5%～1.0%的醋酸雙氧鈾染色，待干燥后即可用透射電鏡(TEM)觀察樣品。

1.4.4二級結構含量測定

參照文獻[13]的方法，并稍加修改。取1 mg充分干燥后的樣品和100 mg KBr進行混合后壓片，在波長范圍為4 000～400 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描次數(shù)為64次的條件下進行吸收光譜測定。

1.4.5熒光光譜測定

參照文獻[12]的方法，并略有改動。采用5 mmol/L、pH值7.2的磷酸鹽緩沖溶液將樣品配制為0.1 mol/L的蛋白溶液，在激發(fā)波長290 nm、發(fā)射波長300～400 nm、夾縫寬度5 nm的條件下測定樣品的內(nèi)源性熒光光譜。

1.4.6表面疏水性測定

參照文獻[11]的方法，并略有改動。采用ANS熒光探針法進行測定，分別將樣品采用0.01 mol/L pH值7.2的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.05～0.4 mg/mL的蛋白溶液，然后取4 mL后加入40 μL的8 mmol/L ANS溶液(0.01 mol/L pH值7.2磷酸鹽緩沖溶液配制后，超聲處理3 min制得)，混勻后靜止3 min，在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長490 nm、夾縫寬度5 nm的條件下測定其熒光強度。將各質(zhì)量濃度下的熒光強度與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度作標準曲線，其斜率即為樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.4.7ζ-電位測定

參照文獻[11]的方法，并略有改動。分別將樣品采用50 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液配制成質(zhì)量分數(shù)0.2%的蛋白溶液，采用Zetasizer Nano ZSP型粒度儀在比色皿長度為1 cm、間距為0.4 cm的條件下測定各樣品的ζ-電位。

1.4.8巰基含量測定

參照文獻[13]的方法，并略有改動。準確稱取2 mg的樣品溶于2 mL pH值8.0的Tris-Gly緩沖液和0.02 mL Ellman溶液，快速混合后25℃靜止15 min，采用分光光度計在412 nm處測定其吸光度A412，并以未加Ellman溶液作為空白，表征游離巰基含量。將樣品采用50 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液配制成0.5 mL 5 mg/mL的溶液，取10 mL后加入2.5 mL含有8 moL/L尿素的Tris-Gly溶液，混勻后靜止反應25 min，采用分光光度計在412 nm處測定其吸光度A412，測出總巰基含量。二硫鍵含量的計算方法為總巰基含量與游離巰基含量之差的1/2。摩爾消光系數(shù)取13 600 L/(mol·cm)，計算巰基含量。巰基和二硫鍵質(zhì)量摩爾濃度計算公式分別為

(2)

(3)

式中F——巰基質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g

L——二硫鍵質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g

D——稀釋系數(shù)

c——蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

F1——總巰基質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g

F2——游離巰基質(zhì)量摩爾濃度，mmol/g

1.4.9流變特性測定

參照文獻[14]的方法，并略有改動。將15 mL 0.1%樣品溶液和5 mL大豆油混合后，24 000 r/min高速均質(zhì)處理1 min制備乳液，取適量體積的乳液加入到旋轉流變儀感應板上，在平板直徑40 mm、角度1°、剪切速率0～100 s-1、取點數(shù)100的條件下，采用旋轉流變儀測定其流變學曲線，并利用Sisko模型擬合其流變學曲線，即

η=η0+Kγn-1

(4)

式中η——表觀黏度，Pa·s

η0——初始表觀黏度，Pa·s

γ——剪切速率，s-1

K——稠度系數(shù)

n——流性指數(shù)

1.4.10乳化活性測定

參照文獻[13]的方法，并略有改動。采用比濁法表征樣品乳化特性。將15 mL 0.001 g/mL樣品溶液和5 mL大豆油混合后，24 000 r/min高速均質(zhì)處理1 min制備乳液，從底部取出50 μL乳液，加入5 mL 0.001 g/mL的SDS溶液，采用分光光度計在500 nm處測定其吸光度，乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計算公式分別為

(5)

(6)

式中E——乳化活性指數(shù)，m2/g

S——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

A0、A30——0、30 min時的吸光度

φ——光程，取0.01 m

θ——油相所占體積分數(shù)，取25%

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復3次，結果用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ANOVA顯著性分析，P<0.05為顯著性差異，采用Origin 9軟件作圖，采用PeakFit 4.12進行紅外圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體粒徑分布的影響

由圖1和圖2(圖中不同字母表示差異顯著，下同)可知，大豆蛋白經(jīng)過熱處理后，粒徑分布發(fā)生了明顯改變，粒徑峰均向右移動，且大分子粒徑的峰面積含量顯著增多，并且PDI(分散指數(shù))顯著升高。這表明當大豆蛋白受到熱處理后蛋白間發(fā)生相互聚集形成大分子粒徑的可溶性熱聚集體[3]，導致粒徑分布圖中第1個粒徑峰右移和PDI顯著升高。當高壓均質(zhì)壓力由30 MPa升高到60 MPa時，大豆蛋白可溶性熱聚集體的粒徑分布圖中第1個峰逐漸向右移動且PDI逐漸降低。當高壓均質(zhì)壓力由90 MPa升高到120 MPa時，大豆蛋白可溶性熱聚集體的粒徑分布圖逐漸向左移動且PDI逐漸升高。這表明低壓條件下的高壓均質(zhì)處理能顯著促進大豆蛋白熱聚集體的聚集，而高壓條件下的高壓均質(zhì)處理能促使大豆蛋白熱聚集體有解聚作用。

2.2 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體濁度的影響

濁度能直觀地反映蛋白顆粒在溶液中的分散狀態(tài)，一定程度上反映了蛋白的聚集狀態(tài)。由圖3可知，HSPIs的濁度顯著高于SPIs。這表明熱處理會引起蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，導致蛋白溶液中的大分子可溶性聚集體含量升高和粒徑增大，增大光線在溶液中的漫反射程度，進而導致濁度升高。隨著高壓均質(zhì)處理壓力的增大，蛋白溶液的濁度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在處理壓力為60 MPa時濁度達到最大。這表明低壓條件下的高壓均質(zhì)處理能通過促進蛋白間的巰基和二硫鍵的轉變而形成大分子可溶性聚集體的結構，導致濁度增加；而高壓條件下的高壓均質(zhì)處理能通過強剪切應力和空化效應導致蛋白聚集體的結構發(fā)生破壞，打破蛋白聚集體，降低粒徑，導致濁度降低[13]。

2.3 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體骨架結構的影響

TEM能通過蛋白質(zhì)骨架結構成像對聚集結構進行表征。由圖4可知，SPIs的TEM圖無明顯聚集區(qū)域和串狀形態(tài)，HSPIs出現(xiàn)樹枝狀和葡萄串狀聚集體形態(tài)。這表明熱處理通過改變分子間的相互作用力，引起大豆蛋白分子間發(fā)生聚集，形成熱聚集體[14]。當高壓均質(zhì)處理壓力由30 MPa升高至60 MPa時，聚集形態(tài)逐漸呈現(xiàn)更多的分支和更為密集的中心，且聚集的面積明顯增大；但當處理壓力超過60 MPa時，逐漸轉變?yōu)楦缮?、更小和更多分支的聚集形態(tài)。研究表明，蛋白質(zhì)聚集過程為蛋白結構展開暴露活性巰基和疏水區(qū)域，活性巰基通過共價和非共價相互作用(如疏水相互作用、靜電引力作用等)形成二硫鍵，進而團聚形成大分子蛋白聚集體[15]。因此，低壓條件下的高壓均質(zhì)處理可能促進了蛋白質(zhì)間的活性巰基和二硫鍵的轉換形成大分子可溶性聚集體；而高壓條件下的高壓均質(zhì)處理所產(chǎn)生的高壓湍流效應、高速剪切效應及空化效應能夠破壞蛋白質(zhì)間的相互作用，打破二硫鍵，破壞蛋白聚集體，減小蛋白粒徑，導致聚集體逐漸轉變?yōu)楦缮ⅰ⒏『透喾种У男螒B(tài)。

2.4 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體二級結構的影響

由圖5和表1可知，熱處理顯著降低了SPI的β-轉角和α-螺旋含量，但顯著增加了β1-折疊、β2-折疊和無規(guī)則卷曲的含量。β-轉角和α-螺旋代表蛋白質(zhì)的有序結構，而β-折疊和無規(guī)則卷曲代表蛋白質(zhì)的無序結構。這表明熱處理能打開蛋白結構，暴露疏水性基團，增強蛋白質(zhì)間的相互作用，進而通過分子間β1-折疊形成蛋白聚集體[16-17]。隨著處理壓力由30 MPa升高到120 MPa，分子內(nèi)β-折疊含量呈現(xiàn)先減小后增大趨勢，而β1-折疊、β2-折疊和無規(guī)則卷曲含量呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，α-螺旋和β-轉角含量逐漸增加。FTIR光譜顯示，高壓均質(zhì)處理對熱聚集體氫鍵有顯著影響，會導致蛋白熱聚集體發(fā)生部分變性和二級結構改變。這表明低壓條件下的高壓均質(zhì)處理促進熱聚集體的有序結構向無序結構轉變，并通過β-折疊形成更大的聚集體。研究表明，蛋白質(zhì)疏水基團暴露和無序結構的增多能誘導蛋白在油水界面更好的吸附[18]。因此，低壓條件下的高壓均質(zhì)可能通過導致大豆蛋白熱聚集體的無序結構增多和構象重排，提高其乳液的穩(wěn)定性。而高壓條件下的高壓均質(zhì)處理會破壞蛋白分子間的疏水性結構區(qū)域，打破分子間的作用力平衡，導致蛋白熱聚集體內(nèi)的β-折疊結構斷裂，由大分子的熱聚集體轉化為小分子的熱聚集體。這與TEM的結果相一致。

表1 不同高壓均質(zhì)條件下大豆蛋白熱聚集體二級結構的相對含量Tab.1 Effect of HPH on the secondary structure of soybean protein thermal aggregate %

2.5 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體熒光光譜的影響

熒光光譜主要反映芳香族氨基酸的微環(huán)境極性變化，能直接表征蛋白結構的三級結構構象變化。蛋白質(zhì)最大吸收波長λmax紅移表明熒光發(fā)色基團暴露，蛋白結構展開，藍移表明蛋白或者亞基發(fā)生了聚集等變化[19]。由圖6可知，未經(jīng)處理的大豆蛋白最大吸收波長λmax為327 nm，而熱處理導致λmax發(fā)生紅移至330 nm，且熒光強度增強。這表明熱處理通過破壞大豆蛋白分子間的相互作用，促進了大豆蛋白結構的展開和構象重組發(fā)生聚集，增加了蛋白中芳香族氨基酸所處環(huán)境的極性，從而增強了熒光發(fā)色基團與水分子的接觸，導致發(fā)生紅移和熒光強度升高[20-21]。隨著高壓均質(zhì)處理壓力的增大，大豆蛋白可溶性熱聚集體的熒光強度出現(xiàn)下降現(xiàn)象，且λmax先藍移后紅移。低壓處理條件下所發(fā)生的藍移和熒光強度下降表明大豆蛋白熱聚集體的芳香族氨基酸從親水性環(huán)境轉移至更疏水的環(huán)境，反映出蛋白聚集體更趨向于再聚集的結構。而高壓處理條件下所發(fā)生的藍移和熒光強度降低表明大豆蛋白熱聚集體發(fā)生解折疊，增強了芳香族氨基酸的水合作用并轉移至親水環(huán)境，并發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象。文獻[22]的研究表明高壓均質(zhì)所產(chǎn)生的高壓、高剪切力和空化作用能通過影響氫鍵和疏水相互作用來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的三級結構。

2.6 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體表面疏水性的影響

蛋白表面疏水性反映蛋白表面疏水性基團的相對含量，對分子間相互作用能力有決定性影響，是衡量蛋白質(zhì)變性程度的重要指標之一。由圖7可知，與SPIs相比，HSPIs的表面疏水性顯著增強；隨著高壓均質(zhì)處理壓力的增強，表面疏水性指數(shù)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且在60 MPa的條件下達到最低，但也顯著高于SPIs。這是因為當?shù)鞍资艿酵饨缂訜釛l件的影響時，蛋白質(zhì)單體發(fā)生可逆的構象變化，其高級結構被打開，內(nèi)源性熒光光譜的λmax發(fā)生紅移現(xiàn)象，分子內(nèi)部疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸側鏈基團暴露，導致HSPIs的表面疏水性顯著增強。經(jīng)過熱處理得到的HSPIs結構展開，暴露出來的疏水性基團增多，而低壓力的高壓均質(zhì)處理增加了蛋白顆粒的碰撞聚集，從而通過共價交聯(lián)和疏水相互作用進一步發(fā)生聚集反應[18]。這與內(nèi)源性熒光光譜的結果相一致。高壓處理HSPIs時，強剪切力對其內(nèi)部隱藏的疏水性基團發(fā)生剪切效應，使更多的疏水性基團發(fā)生暴露并且削弱了蛋白聚集反應，導致表面疏水性隨之增強。

2.7 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體ζ-電位的影響

蛋白質(zhì)聚集是蛋白質(zhì)分子間的靜電和疏水作用間的競爭現(xiàn)象。在維持蛋白溶液體系的穩(wěn)定性和形成不同類型的聚集體中，ζ-電位和表面疏水性指數(shù)的平衡發(fā)揮著重要的作用。當?shù)鞍兹芤褐械挠H水基團能夠提供足夠的斥力時，蛋白的聚集便不再進行。而當疏水性基團的作用較高時，便給蛋白質(zhì)聚集提供動力。研究表明，蛋白質(zhì)分子間的作用力除了與自身性質(zhì)有關外，也取決于外界的加工改性條件[22]。由圖8可知，與SPIs相比，HSPIs的ζ-電位絕對值顯著上升；與HSPIs相比，隨著高壓均質(zhì)處理壓力的升高，ζ-電位絕對值呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。熱處理可以促進可溶性蛋白聚集體結構的打開，誘導了疏水性基團的暴露進而造成ζ-電位絕對值的升高。熱處理后再進行高壓均質(zhì)處理的過程中，蛋白結構進一步展開，且在30、60 MPa高壓均質(zhì)處理后的ζ-電位絕對值均高于SPIs和HSPIs。熱處理能促進可溶性聚集體二級結構和三級結構的改變，從而使更多的帶電氨基酸暴露在分子表面[23]。高壓處理后HSPIs的ζ-電位也會發(fā)生變化，是由于高壓處理會影響蛋白質(zhì)二級結構和疏水能力，并且會誘發(fā)蛋白顆粒發(fā)生聚集和分解，進而導致溶液凝膠體系結構的重組以及溶液電位的改變[24]。熱處理和高壓均質(zhì)處理均會引起蛋白結構發(fā)生變化，引發(fā)疏水基團的暴露和電位的改變，進而影響可溶性聚集體分子的表面性質(zhì)。結合表面疏水性和粒徑分布結果可以推斷，低壓力的高壓均質(zhì)處理可以促進聚集體進行再次聚集，進而減少疏水性基團的暴露，提高各分子之間的斥力，增大溶液聚集體的粒徑，而高壓力的高壓均質(zhì)處理會誘導蛋白結構展開得更加完全且蛋白分子被解離成更小的分子，使更多的疏水性基團發(fā)生暴露，導致蛋白質(zhì)表面的極性氨基酸以及表面電荷量減少，從而使得ζ-電位絕對值下降。

2.8 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體巰基含量的影響

由圖9可知，與SPIs相比，HSPIs的二硫鍵含量顯著上升，游離巰基含量顯著下降，總巰基含量無顯著性差異；與HSPIs相比，隨著高壓均質(zhì)處理壓力的升高，二硫鍵含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，游離巰基呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，總巰基含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。游離巰基含量可以反映外界處理條件對蛋白共價相互作用的影響。熱處理可以促進游離巰基氧化成二硫鍵和發(fā)生-SH-SS互換反應，從而發(fā)生游離巰基減少和二硫鍵增多的現(xiàn)象[13]；隨著高壓均質(zhì)處理壓強的增大，游離巰基含量整體呈現(xiàn)升高的趨勢，這是因為在壓力處理過程中蛋白質(zhì)分子發(fā)生了部分去折疊或者離子化程度有所增強，游離巰基變得更加活潑且會隨著場強和處理時間的增加而增強，但在壓力為60 MPa時游離巰基含量略有下降，其原因可能為在此壓力處理下聚集體形成二硫鍵的程度大于游離巰基的生成和表達[10]。二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構象和聚集起著重要作用，可以使蛋白質(zhì)分子相互作用形成更加緊密的結構。結果表明二硫鍵的含量隨著壓力增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其原因可能為低壓力處理可以促進蛋白分子間和分子內(nèi)的二硫鍵形成，促進交聯(lián)反應和聚集體的形成，而高壓力處理下的強剪切作用會使聚集體自身的二硫鍵發(fā)生斷裂，導致蛋白粒徑減小，結構展開，疏水性增強。

2.9 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體流變特性的影響

由圖10和表2可知， Sisko模型可以擬合所有的乳液流變學曲線，決定系數(shù)均為0.99，且均呈現(xiàn)非牛頓流體的剪切稀化現(xiàn)象，流性指數(shù)n在0.78～0.88之間。對于穩(wěn)定的乳液，剪切變稀行為可能是由乳液中蛋白分子間的相互作用引起的分子間吸引作用及形成的網(wǎng)狀結構所造成的[25]。與SPIs乳液相比，HSPIs乳液的表觀黏度和稠度系數(shù)顯著升高；在30～120 MPa時，隨著高壓均質(zhì)處理壓力的升高，乳液的表觀黏度呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，稠度系數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。但當乳液體系在受到初始外界剪切應力時，表觀黏度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這表明熱處理增加了乳液的表觀黏度和稠度指數(shù)，而高壓均質(zhì)處理對乳液流變學性質(zhì)的影響取決于處理壓力，其變化趨勢與聚集體粒徑的變化趨勢相一致。研究表明，乳液的流變性主要取決于表面活性劑及分散相的體積分數(shù)及其粒徑分布，假設乳液內(nèi)部蛋白分子所形成的網(wǎng)狀結構具有相似的剛性，那么較大分子粒徑的蛋白聚集體就需要更大的外界剪切應力才能發(fā)生流變行為[14]。因此，當外界剪切應力剛作用于乳液時，大豆蛋白熱聚集體表現(xiàn)出更大的流動阻力和表觀黏度。而相關研究表明，蛋白聚合程度的提高和體積分數(shù)的增大可以顯著增加乳液體系中蛋白分子間基團的相互作用，形成更多更穩(wěn)定的網(wǎng)狀結構以便提高束縛溶劑分子的能力，進而增強其稠度系數(shù)和表觀黏度[26]。這可能也是高壓均質(zhì)處理調(diào)節(jié)大豆蛋白熱聚集體流變性質(zhì)的原因之一。

表2 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體流變學特性的影響Tab.2 Effect of HPH on rheological properties of soybean protein thermal aggregates

2.10 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體乳化活性的影響

由表3可知，熱處理顯著提高了SPIs的EAI和ESI。這是因為熱處理使大豆球蛋白的三級結構打開，暴露出疏水性基團，改變了蛋白分子表面的親水/親油性，降低油水界面的界面張力和促進乳液中的油滴形成凝膠網(wǎng)狀結構，增強其在油/水界面上的吸附能力和乳液的黏度，導致其乳化活性和乳化穩(wěn)定性的增強[7]。隨著高壓均質(zhì)處理壓力的升高，EAI和ESI呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在高壓均質(zhì)壓力為60 MPa時達到最大。研究表明，高壓均質(zhì)所產(chǎn)生的高壓、湍流、剪切和空化效應可以通過影響蛋白游離巰基和疏水性基團的暴露，導致其EAI和ESI發(fā)生顯著改變[27]。結合上文實驗結果發(fā)現(xiàn)，低壓條件下的高壓均質(zhì)處理可以促進游離巰基和二硫鍵發(fā)生互換反應和ζ-電位絕對值升高，導致表面疏水性下降，從而誘導大粒徑的可溶性聚集體形成。而大分子可溶性聚集體的形成可以顯著增加油/水界面上吸附蛋白質(zhì)的含量，增強界面活性，降低油水界面張力，進而提高蛋白質(zhì)的乳化能力和乳化穩(wěn)定性[28]。文獻[11]的研究結果也表明適當壓力的高壓均質(zhì)處理可以顯著降低液滴間的界面張力和增強靜電斥力，防止液滴破碎，進而增強乳液穩(wěn)定性。而當高壓均質(zhì)壓力過高時，可溶性聚集體發(fā)生進一步的破碎重組，形成粒徑較小的蛋白體，可能會造成界面膜的穩(wěn)定性下降和增強絮凝效應，進而導致乳化活性和乳液穩(wěn)定性的降低。

表3 高壓均質(zhì)對大豆蛋白熱聚集體乳化活性的影響Tab.3 Effect of HPH on emulsification activity of soybean protein thermal aggregates

3 結束語

以大豆蛋白為原料，采用熱處理制備大豆蛋白熱聚集體，探討不同壓力下高壓均質(zhì)技術對其結構和乳化活性的影響。結果表明：熱處理會引起大豆蛋白結構展開、疏水性基團暴露，通過疏水相互作用形成二硫鍵，蛋白骨架結構變大，使粒徑和濁度增大，形成可溶性熱聚集體，進而導致乳化活性提高。與可溶性熱聚集體相比，低壓力的高壓均質(zhì)處理可以促進熱聚體發(fā)生再聚集，使粒徑和濁度逐漸增大、骨架結構變密、無序結構增多，疏水性降低，ζ-電位絕對值和二硫鍵含量升高，進而導致乳化活性的提高；而高壓力的高壓均質(zhì)處理會導致熱聚集體的二硫鍵和骨架結構發(fā)生大量斷裂，分子結構展開，疏水性位點大量暴露，導致疏水性增強、蛋白分子鏈變短、粒徑和ζ-電位絕對值降低，進而導致乳化活性的降低。