陳 凡,周堉涵,毛根穩(wěn),閔文宇,蔣榮軒,劉儉濤,姬文晨,李 萌*

(1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,西安 710061;2 西安醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院;3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)系;*通訊作者,E-mail:limeng@xjtufh.edu.cn)

關(guān)節(jié)軟骨損傷是由于創(chuàng)傷或老化等原因所引起的一種疾病,其發(fā)病率較高[1]?，F(xiàn)有的治療方案分為初級治療、過渡治療和最終治療。初級治療主要包括補充軟骨基質(zhì)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物、關(guān)節(jié)鏡清理增生組織等方法,這些治療措施雖然具有一定效果,但均無法達到徹底治愈的目的[2]。過渡治療主要通過生物軟骨的修復(fù)從而延緩關(guān)節(jié)晚期的蛻變,其具有一定的治療效果,但也存在以下問題,如微骨折技術(shù)滲出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨缺損處雖然可以形成纖維軟骨,但其生物力學(xué)性能與透明軟骨仍然相差較遠(yuǎn)[3-5]。最終治療的方法則是人工關(guān)節(jié)置換和關(guān)節(jié)融合術(shù),這種方式雖然可以從根本上解決病人的癥狀,但其創(chuàng)傷大,花費高,且對病人的身心往往會造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān),并不是理想的治療方式[6]。所以,尋找新的治療方法,一直是臨床工作者探索和追求的方向。

利用3D打印構(gòu)建與正常骨軟骨界面機械強度、結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能相似的骨軟骨支架是解決這一問題的可行方案[7-10]。骨軟骨復(fù)合體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,單一的結(jié)構(gòu)設(shè)計通常不能滿足骨組織缺損修復(fù)的需要,所以采用合理的設(shè)計方法使得支架具有軟骨層、軟骨下骨層的復(fù)合結(jié)構(gòu)是目前研究的熱點[11,12]。然而,現(xiàn)有的骨軟骨支架三維結(jié)構(gòu)多為簡單的規(guī)則空隙,與自然松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)相差較大,這就導(dǎo)致長入支架空隙的新生骨不具備正常松質(zhì)骨骨小梁的結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致修復(fù)部位的松質(zhì)骨骨小梁應(yīng)力曲線的規(guī)律性和非均勻的各向異性被破壞,進而使得修復(fù)部位的松質(zhì)骨強度低于周圍正常骨組織,最終導(dǎo)致軟骨修復(fù)效果差,以及疾病復(fù)發(fā)率升高[13,14]。

所以,設(shè)計與自然骨軟骨復(fù)合體的微結(jié)構(gòu)相似的仿生骨軟骨支架顯得尤為重要,為了解決上述問題,本課題組擬對正常人體膝關(guān)節(jié)股骨端的骨組織進行多點取材,獲得了軟骨、軟骨下骨板、松質(zhì)骨骨小梁及松質(zhì)骨間隙等形態(tài)計量學(xué)參數(shù),依靠采集的數(shù)據(jù)進行了骨軟骨支架數(shù)字化三維模型設(shè)計,以期為仿生骨軟骨支架的制造提供詳實的前期依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取

本研究共測量了3具非骨組織疾病致死的成年人尸體,捐獻者平均年齡為(53.7±3.2)歲,1具為女性,2具為男性。來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院。該項目得到了西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。充分暴露尸體左右股骨膝關(guān)節(jié)端,在雙側(cè)關(guān)節(jié)面的髕面、外側(cè)髁及內(nèi)側(cè)髁的正中位置選取一邊長為1.2 cm的正方形區(qū)域并標(biāo)記,醫(yī)用擺鋸限深1.2 cm,沿標(biāo)記線垂直于骨面切割,獲得邊長為1.2 cm×1.2 cm×1.2 cm的正方體骨塊。三具尸體的取材方法同上,一共18個標(biāo)本,保存于福爾馬林溶液中備用。

1.2 軟骨及軟骨下骨板厚度測量

標(biāo)本由微米X射線三維成像系統(tǒng)(Micro-CT, YXLON Y.Cheetah,德國)進行斷層掃描,并導(dǎo)入VG Studio MAX 3.4(Volume Graphics,德國)軟件進行三維重建。使用軟件中幾何測量模塊,于各標(biāo)本冠狀切面等距測量6次軟骨及軟骨下骨板厚度,并計算不同部位標(biāo)本的軟骨與軟骨下骨板厚度的比值。

1.3 松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)獲取

選擇感興趣區(qū)(ROI)分析體積為1 cm3的正方體骨組織,獲得松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)包括材料體積/總體積(BV/TV)、平均小梁數(shù)量(TbN)、平均小梁厚度(TbTh)、平均小梁間距(TbSp)。

1.4 松質(zhì)骨間隙及其形態(tài)計量學(xué)參數(shù)獲取

選擇ROI反轉(zhuǎn)的輪廓,獲得松質(zhì)骨間隙的形態(tài)計量學(xué)參數(shù)。

1.5 仿生骨軟骨支架模型設(shè)計

利用VG Studio MAX 3.4軟件,在重建后的骨軟骨復(fù)合體三維模型中選擇直徑8 mm,高10 mm的圓柱體ROI,將該ROI及ROI反轉(zhuǎn)的輪廓進行表面測定并渲染后,輸出stl(Stereo Lithography,光固化立體造型術(shù))文件。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本掃描截面圖與重建圖

Miro-CT掃描標(biāo)本結(jié)果顯示:關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨板、松質(zhì)骨界限清晰,未見骨組織病變。標(biāo)本軟骨及軟骨下骨板厚度相對均一,松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)完整,未見變細(xì)或數(shù)量稀疏(見圖1)。

A.標(biāo)本冠狀位截面圖(a.關(guān)節(jié)軟骨;b.軟骨下骨板;c.松質(zhì)骨);B.松質(zhì)骨及軟骨下骨板三維重建圖;C.松質(zhì)骨三維重建圖;D.軟骨下骨板三維重建圖圖1 標(biāo)本截面及重建圖Figure 1 Section and reconstruction of specimens

2.2 髕面軟骨厚度、軟骨下骨板厚度、軟骨厚度/骨板厚度與外、內(nèi)側(cè)髁比較

髕面軟骨厚度大于外側(cè)髁、內(nèi)側(cè)髁,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);髕面軟骨下骨板厚度大于外側(cè)髁、內(nèi)側(cè)髁,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);髕面軟骨厚度/骨板厚度小于外側(cè)髁、內(nèi)側(cè)髁,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

表1 不同部位軟骨厚度、軟骨下骨板厚度、軟骨厚度/骨板厚度比較

2.3 髕面松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)與外、內(nèi)側(cè)髁比較

髕面BV/TV與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);髕面TbN與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);髕面TbTh與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);髕面TbSp與內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),髕面與外側(cè)髁TbSp差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 不同部位松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)比較

2.4 髕面松質(zhì)骨間隙形態(tài)計量學(xué)參數(shù)與外、內(nèi)側(cè)髁比較

髕面BV/TV與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);髕面TbN與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);髕面TbTh與內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),髕面與外側(cè)髁TbTh差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);髕面TbSp與外、內(nèi)側(cè)髁相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

表3 不同部位松質(zhì)骨間隙形態(tài)計量學(xué)參數(shù)比較

2.5 仿生骨軟骨復(fù)合支架模型設(shè)計

基于人類膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面骨軟骨復(fù)合體的局部微結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù),使用VG Studio MAX 3.4軟件進行三維重構(gòu)后顯示,選用骨小梁微形態(tài)計量學(xué)微參數(shù)設(shè)計出的非降解材料仿生多層生物支架模型具有與正常骨小梁一致的三維結(jié)構(gòu);選用松質(zhì)骨間隙形態(tài)計量學(xué)微參數(shù)設(shè)計的可降解材料仿生多層生物支架模型,其空隙結(jié)構(gòu)與正常骨小梁三維結(jié)構(gòu)一致(見圖2)。

圖2 仿生骨軟骨復(fù)合支架模型設(shè)計Figure 2 Model design of multilayer biomimetic osteochondral composite scaffold

3 討論

近年來,不少學(xué)者對自然骨軟骨復(fù)合體的生物力學(xué)性能與其微結(jié)構(gòu)特征進行研究,結(jié)果表明膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面的骨軟骨復(fù)合體由表到里分為四層結(jié)構(gòu):關(guān)節(jié)軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨板和軟骨下松質(zhì)骨[15,16]。為達到理想的軟骨修復(fù)效果,既往研究在設(shè)計骨軟骨支架時,對其軟骨及軟骨下骨板層的分層結(jié)構(gòu)進行了精細(xì)化的研究與設(shè)計[17],但忽視了不同修復(fù)部位軟骨厚度及軟骨下骨板的厚度差異對修復(fù)效果帶來的影響。軟骨層和軟骨下骨板有不同的應(yīng)力緩沖機制[18],應(yīng)力傳導(dǎo)至軟骨層,再通過軟骨下骨板進一步的緩沖和傳導(dǎo)作用,將其分散至下方的松質(zhì)骨骨小梁,這種應(yīng)力應(yīng)變的緩沖和分散機制非常有利于能量的吸收和緩沖[19]。本實驗結(jié)果顯示,膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面負(fù)重區(qū)即外側(cè)髁、內(nèi)側(cè)髁軟骨厚度及軟骨下骨板厚度明顯小于髕面,這可能與外、內(nèi)側(cè)髁所處的生物力學(xué)環(huán)境有關(guān),具體原因及意義,需后續(xù)進一步研究。以股骨膝關(guān)節(jié)面為例,支架的軟骨及軟骨下骨層材料的厚度需要根據(jù)軟骨缺損部位選定,精確而合適的厚度才能獲得更好的修復(fù)效果。與此同時,不同位置的軟骨厚度與軟骨下骨板的厚度比值差異明顯,該比值可能與軟骨與骨板之間的應(yīng)力傳遞或分配有關(guān),在支架設(shè)計時,還需將該因素考慮其中[20]。

良好的固定和支撐是軟骨修復(fù)必要因素[21],在絕對尺寸缺損模型下,缺乏軟骨下骨的骨軟骨修復(fù)注定失敗[22]。近年來,有學(xué)者設(shè)計出具有規(guī)則空隙的骨軟骨支架[23-25],此類支架為軟骨的再生提供了支撐與固定,并取得了較好的實驗結(jié)果。但此類支架的結(jié)構(gòu)與正常骨小梁相差較大,骨小梁與松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)強度密切相關(guān),由此推測,具有骨小梁結(jié)構(gòu)的骨軟骨支架將獲得更優(yōu)的修復(fù)效果。3D打印技術(shù)的發(fā)展與成熟為骨組織工程支架的設(shè)計與制造帶來了新的機遇與挑戰(zhàn),本課題組對人類膝關(guān)節(jié)股骨關(guān)節(jié)面進行了多點取材,并應(yīng)用高分辨率CT獲取了松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)參數(shù)。基于此,利用松質(zhì)骨骨小梁形態(tài)計量學(xué)微參數(shù),設(shè)計了具有仿生結(jié)構(gòu)的非可降解支架模型,該支架形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常骨小梁一致,以仿生支架本身結(jié)構(gòu)代替原有骨小梁,達到仿生的目的。同時,不同部位的微參數(shù)分析結(jié)果顯示:BV/TV、TbN、TbTh三組數(shù)據(jù)與取材部位之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但外側(cè)髁與髕面TbSp差異較明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義,TbSp是設(shè)計支架時支架孔徑的參考依據(jù),為了提高支架的仿生性,用于修復(fù)不同缺損部位的支架,需要考慮設(shè)計不同的孔徑。

本研究獲取了標(biāo)本骨小梁的反轉(zhuǎn)輪廓——松質(zhì)骨間隙模型,并測得該模型各項形態(tài)計量學(xué)微參數(shù)。根據(jù)此,本課題組設(shè)計出了具有仿生結(jié)構(gòu)的可降解支架模型。理想條件下,新生骨組織會完全填充支架空隙[26],當(dāng)支架完全降解后,修復(fù)部位新生骨形態(tài)結(jié)構(gòu)會與原有骨小梁結(jié)構(gòu)一致。盡可能使修復(fù)部位骨小梁應(yīng)力曲線的規(guī)律性和非均勻的各向異性與周圍正常骨小梁一致,以達到更好的修復(fù)效果。進一步地,松質(zhì)骨間隙模型的形態(tài)計量學(xué)微參數(shù)分析結(jié)果顯示:BV/TV、TbN、TbSp三組數(shù)據(jù)與取材部位之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但外側(cè)髁與髕面TbTh差異較明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義,所以設(shè)計支架時,不同位置還需設(shè)計不同的小梁厚度,以提高支架的仿生性。

本研究測量了膝關(guān)節(jié)股骨面骨軟骨復(fù)合體的局部微結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù),比較分析了不同部位各數(shù)據(jù)之間的差異,根據(jù)所得到的數(shù)據(jù)設(shè)計出兩種數(shù)字化三維仿生支架模型——仿生非可降解支架模型及仿生可降解支架模型。但是如需根據(jù)此模型制造骨軟骨支架,還需結(jié)合支架材料的性能,以及制造技術(shù)綜合考慮。研究的不足之處在于樣本量偏少,可能對各參量的普遍性有一定影響,但能夠?qū)θ蘸蟾油晟频闹Ъ茉O(shè)計方案提供一定參考。