葫蘆茶苷對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的影響及機(jī)制研究

唐愛(ài)存，俞 淵，羅 遠(yuǎn)，盧秋玉，王 兵

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 科研部，廣西 南寧 530023；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣西 南寧 530021）

肝纖維化是由多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)的增殖與降解失去平衡而導(dǎo)致纖維結(jié)締組織在肝臟內(nèi)異常沉積的病理過(guò)程，肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化是肝纖維化形成的最終共同途徑，并且是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究表明HSC 的活化和轉(zhuǎn)化在肝纖維化中起著關(guān)鍵作用[1-2]。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展到肝硬化以及肝癌的必經(jīng)階段。目前在診治方面雖然有一些進(jìn)展，但仍缺乏確定有效的藥物。因此，阻斷細(xì)胞因子的促增殖作用有望成為治療肝纖維化的有效措施。

葫蘆茶苷是從中草藥葫蘆茶中提取分離得到的活性成分，前期研究發(fā)現(xiàn)[3-6]，葫蘆茶苷具有保肝作用，而且體外對(duì)乙型肝炎病毒具有很強(qiáng)的抑制作用。本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)葫蘆茶苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)清除自由基和炎性反應(yīng)，抑制膠原合成與沉積，減輕肝星狀細(xì)胞的活化[7]。為進(jìn)一步探討葫蘆茶苷在體外的抗肝纖維化作用，本實(shí)驗(yàn)以大鼠肝星狀細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積以及相關(guān)蛋白的表達(dá)方面探討其可能機(jī)制，以期為深入研究開(kāi)發(fā)葫蘆茶抗肝纖維化提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

葫蘆茶苷樣品（純度＞98.0%）由本課題組從葫蘆茶Tadehagi triquetrum （L.） Ohashi 中分離而得，采用無(wú)血清高糖DMEM 培養(yǎng)基配成濃度為500 μg/mL母 液， 4 ℃保 存 備 用。 秋 水 仙 堿 片（ 批 號(hào)：20181001，規(guī)格：0.5 mg，廣東彼迪藥業(yè)有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（CatNO13200 035，美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（CatNO16000 036，?？寺。鹊鞍酌福绹?guó)Amersco 公司）；PBS（LotNO40903060T，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；CCK 8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；First Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：00064478，美國(guó)MBI 公司）；瓊脂糖（批號(hào)：17065318，西班牙Biowest 公司）；2×PCR TaqMix（批號(hào)：9108，日本Takara 公司）；RIPA 裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Hyp、HA、TIMP 1 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其它試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞株

HSC T6 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，為SV40轉(zhuǎn)染SD 大鼠HSC，其表型為活化的HSC，表達(dá)高水平的I 型膠原，本研究室自行培養(yǎng)傳代。

1.3 儀器

Model 311 型CO2孵箱（美國(guó)Thermo Forma 公司）；Model 450 型自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Rad 公司）；XD 101 型倒置顯微鏡（南京江南光電集團(tuán)股份有限公司）；722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；PAC 300 型低壓電泳儀、ABI 9700 型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、HD 4N 型核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Bio Rad 公司）；Tanon 5200 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 作為培養(yǎng)液，將HSC T6 細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)，8 h 即可貼壁生長(zhǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每?jī)商旄鼡Q一次細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞長(zhǎng)滿后，采用0.25%胰酶消化傳代。

2.2 CCK 8 法檢測(cè)葫蘆茶苷對(duì)HSC T6 增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC T6 細(xì)胞經(jīng)0.25% 胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)至 1 × 104/mL細(xì)胞懸液，加入96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，置CO2孵箱（37 ℃，5% CO2）中培養(yǎng)。24 h 后細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸除全部培養(yǎng)液，加入6 個(gè)終濃度分別為10、20、40、80、160、320 μg/mL 的葫蘆茶苷藥液，并設(shè)置空白對(duì)照組，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK 8，混勻后培養(yǎng)箱中孵育 2 h，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm）讀取各孔OD 值，并計(jì)算不同藥物濃度對(duì)HSC T6 細(xì)胞的增殖抑制率。

2.3 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液Hyp、HA 和TIMP 1的含量

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC T6 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置 CO2孵箱（37 ℃，5%CO2）中培養(yǎng)。24 h 后細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好，吸除全部培養(yǎng)液。分別設(shè)置空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（秋水仙堿 6.25 μg/mL）、葫蘆茶苷劑量組（20、40、80 μg/mL），每個(gè)濃度設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔，置CO2孵箱 （37℃，5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞上清液，分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA 法測(cè)定細(xì)胞上清液中Hyp、HA 和TIMP 1 的含量。

2.4 FQ PCR 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Col I、TGF β1、α SMA和PDGF BB mRNA 的表達(dá)

按照“2.3”項(xiàng)下的細(xì)胞分組與給藥，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液，收集各組細(xì)胞，采用 Trizol 一步法提取細(xì)胞總RNA，再由RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)，以β actin 為內(nèi)參，各基因引物序列見(jiàn)表1。FQ PCR 反應(yīng)體系為1 μL cDNA 模板，10 μL ddH2O，8 μL SYBR Premix Ex TaqTM 和上、下游引物各0.5 μL，總反應(yīng)體系為20 μL，并保證所有反應(yīng)體系的組成（如酶濃度、引物濃度等）一致。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s， 56℃退火20 s，72℃延伸20 s，共反應(yīng)55 個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸5 min。結(jié)果采用比較2-△△CT法分析各基因在細(xì)胞中表達(dá)的相對(duì)含量。

表1 基因引物序列表Tab. 1 The table of gene primer sequence

2.5 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白的表達(dá)

按照“2.3”項(xiàng)下的細(xì)胞分組與給藥，連續(xù)培養(yǎng)24 h 后，棄去上清液，收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解細(xì)胞得總蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠（SDS PAGE）進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離，然后再轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜上，50 g/L 脫脂奶粉封閉液封閉1 h，分別加入兔抗鼠TGF β1、α SMA 、PDGF BB 和內(nèi)參β actin 多克隆抗體（1 ∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液洗膜 3 次，再加入二抗室溫孵育2 h 后，用TBST 緩沖液清洗，以ECL 顯色后，置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)上成像。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β actin 條帶的灰度值比值來(lái)表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 葫蘆茶苷對(duì)HSC T6 細(xì)胞增殖的影響

與空白組比較，葫蘆茶苷各劑量組均能抑制HSC T6 細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01），且隨著給藥劑量的增加，肝星狀細(xì)胞被抑制效果越明顯，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以濃度為20、40、80 μg/mL 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。

表2 葫蘆茶苷對(duì)HSC T6 細(xì)胞增殖的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 2 Effect of Tadehaginoside on the proliferation of HSC T6 cells（±s，n ＝ 6）

表2 葫蘆茶苷對(duì)HSC T6 細(xì)胞增殖的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 2 Effect of Tadehaginoside on the proliferation of HSC T6 cells（±s，n ＝ 6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別 濃度/（μg/mL） OD 值 抑制率/%空白對(duì)照組 - 0.557 ± 0.056 0葫蘆茶苷不同劑量組10 0.483 ± 0.044* 13.29 ± 1.56*20 0.375 ± 0.040** 32.68 ± 3.71**40 0.326 ± 0.031** 41.47 ± 5.02**80 0.245 ± 0.017** 56.01 ± 5.97**160 0.208 ± 0.011** 62.66 ± 6.85**320 0.192 ± 0.010** 65.53 ± 7.13**55.253 38.655 0.005 0.007 F P

3.2 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影響

結(jié)果顯示， 葫蘆茶苷各劑量組均能降低HSC T6細(xì)胞上清液中Hyp、HA 和TIMP 1 的含量，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01），但與秋水仙堿組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 3 Effect of Tadehaginoside on Hyp, HA and TIMP 1 content in cell supernatant（±s，n ＝ 6）

表3 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞上清液Hyp、HA、TIMP 1 含量的影響（±s，n ＝ 6）Tab. 3 Effect of Tadehaginoside on Hyp, HA and TIMP 1 content in cell supernatant（±s，n ＝ 6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

TIMP 1/（pg/mL）空白對(duì)照組 - 11.75 ± 1.82 156.34 ± 17.35 2 867.23 ± 182.55秋水仙堿組2 60.25 7 9..34 62 ±± 10..0964*** 110112..6023 ±± 1123..4006****22 36 6491..43 45 ±±115739..2457***40 8.58 ± 0.81** 96.74 ± 10.58** 2 506.77 ± 148.06**80 6.71 ± 0.90** 87.07 ± 9.64** 2 382.12 ± 137.99**35.227 30.899 24.188 0.008 0.009 0.009葫蘆茶苷低劑量組組別 濃度/（μg/mL）Hyp/（μg/mL）HA/（ng/mL）葫蘆茶苷高劑量組葫蘆茶苷中劑量組F P

3.3 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表達(dá)的影響

FQ PCR 結(jié)果表明，與空白組比較，葫蘆茶苷各劑量組能降低HSC T6 細(xì)胞內(nèi)Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），但與秋水仙堿組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），詳見(jiàn)表4。

3.4 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞內(nèi) TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，葫蘆茶苷各劑量組能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)TGF β1、α SMA、PDGF BB 蛋白的表達(dá)，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01），但與秋水仙堿組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），詳見(jiàn)圖1、表5。

表4 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 6）Tab. 4 Effects of Tadehaginoside on the expression of Col I, TGF 1,SMA, PDGF BB mRNA（±s，n = 6）

表4 葫蘆茶苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)Col I、TGF β1、α SMA、PDGF BB mRNA 表達(dá)的影響（±s，n = 6）Tab. 4 Effects of Tadehaginoside on the expression of Col I, TGF 1,SMA, PDGF BB mRNA（±s，n = 6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

Col I TGF β1 α SMA PDGF BB空白對(duì)照組 - 1.00 ± 0.05 1.00 ± 0.06 1.00 ± 0.05 1.00 ± 0.08秋水仙堿組 6.25 0.65 ± 0.09** 0.57 ± 0.08** 0.71 ± 0.09** 0.69 ± 0.10**葫蘆茶苷低劑量組組別 濃度/（μg/mL）20 0.87 ± 0.11* 0.80 ± 0.10* 0.90 ± 0.13* 0.85 ± 0.13*葫蘆茶苷中劑量組40 0.73 ± 0.08** 0.69 ± 0.09** 0.75 ± 0.12* 0.78 ± 0.09*葫蘆茶苷高劑量組80 0.58 ± 0.07** 0.60 ± 0.07** 0.66 ± 0.09** 0.59 ± 0.08**F 85.023 75.695 80.055 78.951 P 0.003 0.004 0.003 0.004

圖1 葫蘆茶苷對(duì)TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表達(dá)的影響Fig. 1 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression

表5 葫蘆茶苷對(duì)TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 6）Tab. 5 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression（±s，n = 6）

表5 葫蘆茶苷對(duì)TGF β1、α SMA 和PDGF BB 蛋白表達(dá)的影響（±s，n = 6）Tab. 5 Effects of Tadehaginoside on TGF 1, α SMA and PDGF BB protein expression（±s，n = 6）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

（μg/mL） TGF β1/β actin α SMA/β actin PDGF BB/β actin空白對(duì)照組 - 1.062 ± 0.155 0.806 ± 0.106 1.388 ± 0.165秋水仙堿組 6.25 0.569 ± 0.085** 0.529 ± 0.075** 0.632 ± 0.079**葫蘆茶苷低劑量組 20 0.813 ± 0.011* 0.725 ± 0.091* 0.827 ± 0.103*葫蘆茶苷中劑量組 40 0.601 ± 0.079** 0.624 ± 0.081** 0.753 ± 0.099**葫蘆茶苷高劑量組 80 0.578 ± 0.084** 0.591 ± 0.075** 0.665 ± 0.083**F 36.816 52.933 42.186 0.007 0.005 0.006 P組別 濃度/

4 討論

目前研究認(rèn)為肝纖維化主要是由ECM 引起的，ECM 在肝臟中過(guò)量產(chǎn)生和沉積，打破了細(xì)胞外基質(zhì)增殖和降解的平衡[8]，其中肝星狀細(xì)胞（HSCs）是慢性肝病中ECM 增加的主要來(lái)源，肝星狀細(xì)胞的激活導(dǎo)致各種肝損傷，同時(shí)分泌Hyp、HA、TIMP 1、TGF β1、α SMA 和PDGF BB，繼續(xù)激活肝星狀細(xì)胞[9]，因此，抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，誘導(dǎo)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是可能的抗纖維化策略。

TGF β1 通過(guò)促進(jìn)HSCs 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，刺激ECM 的合成并抑制其降解，從而導(dǎo)致HSC 永久活化，而HSC 細(xì)胞活化后可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞表達(dá)高水平的TGF β1，進(jìn)一步誘導(dǎo)靜止的HSCs 向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化并增殖。因此，TGF β1 是導(dǎo)致肝纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子，通過(guò)抑制TGF β1 的產(chǎn)生或阻斷其生物活性來(lái)抑制HSC 的激活，被認(rèn)為是治療抗纖維化的重要靶點(diǎn)[10]。

5 結(jié)論

本研究以大鼠肝星狀細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積以及相關(guān)蛋白的表達(dá)方面探討葫蘆茶苷抗肝纖維化作用機(jī)制，研究證實(shí)葫蘆茶苷體外具有抗肝纖維化作用，其機(jī)制可能與抑制HSC T6 細(xì)胞的增殖，下調(diào)TGF β1、α SMA和PDGF BB 蛋白的表達(dá)，從而減少肝細(xì)胞外基質(zhì)Hyp、HA、TIMP 1 的合成和沉積有關(guān)。