于 爽，吳 穎，李佳昕，齊 航，馬嬌艷，林 楠

(1.錦州市中心醫(yī)院 消化科，遼寧 錦州121000；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，吉林 長春130021)

熱休克蛋白90(HSP90)作為細胞內(nèi)關(guān)鍵的伴侶分子，能夠?qū)Χ喾N客戶蛋白的穩(wěn)定性和功能發(fā)揮調(diào)控作用，這些客戶蛋白直接參與調(diào)節(jié)細胞生長和存活[1-3]。在腫瘤細胞中多種HSP90客戶蛋白發(fā)生突變或者過表達，因此，抑制HSP90能夠同時降解多個客戶蛋白為腫瘤的治療提供了新途徑[4-5]。線粒體是細胞的能量工廠，為細胞的生存提供了最基本的能量供應(yīng)[6]。肝臟作為機體內(nèi)藥物代謝的主要場所，需要大量的能量維持其基本功能，因此維持肝細胞內(nèi)線粒體功能的穩(wěn)定是避免肝細胞損傷的重要靶點[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSP90能夠協(xié)助線粒體蛋白進入線粒體，進而調(diào)控線粒體功能[8]。但是，HSP90抑制劑作為新興的抗腫瘤藥對肝臟組織作用尚不明確。因此，本研究以結(jié)腸癌荷瘤小鼠為基礎(chǔ)，分析HSP90在結(jié)腸癌介導(dǎo)肝臟損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物分組及給藥 健康的SPF級BALB/C雄性6-8周齡小鼠20只購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(吉)-2020-0002]，進行隨機分組，分為對照組和PU-H71組，每組各10只。將5×106結(jié)腸癌CT-26細胞(購自中國科學(xué)院上海細胞庫)接種至小鼠右后腿外側(cè)。待腫瘤直徑到3 mm時，經(jīng)尾靜脈給藥，按2 mg/kg劑量給予PU-H71，每周2次，持續(xù)給藥2周，對照組給予同樣體積生理鹽水。

1.1.2實驗材料 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。IL-1β、IL-6和TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于R&D公司。Trizol購于日本TAKARA公司。RT-PCR試劑盒、qPCR試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.3實驗設(shè)備 光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；恒溫培養(yǎng)箱、離心機(美國Thermo Fisher)；全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)；PCR儀、實時定量熒光PCR儀(美國Bio-Red)。

1.2 方法

1.2.1血清生化指標(biāo)檢測 小鼠采取摘眼球取血，將獲得的血樣在室溫條件下3 000 rpm離心10 min，將獲得的血清嚴格按著AST、ALT、MDA和SOD檢測試劑盒說明書對血清中各酶的活性進行檢測。AST和ALT采用510 nm波長測定吸光度，MDA采用532 nm波長測定，SOD采用450 nm波長測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

1.2.2病理學(xué)檢測 取肝組織于4%多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后切片，經(jīng)二甲苯進行脫蠟處理，梯度乙醇溶液清洗(100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-80%乙醇-75%乙醇)，然后經(jīng)蒸餾水水洗，蘇木精染色后采用鹽酸乙醇進行分化，自來水浸泡后進行伊紅染色，伊紅染色后經(jīng)梯度酒精(80%乙醇-90%乙醇-95%乙醇-95%乙醇-100%乙醇-100%乙醇)、二甲苯進行脫水處理，最后經(jīng)中性樹脂封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3血清炎癥因子檢測 小鼠采取摘眼球取血，將獲得的血樣在室溫條件下3 000 rpm離心10 min，將獲得的血清嚴格按酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明進行操作，檢測血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測570 nm波長的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各炎癥因子的含量。

1.2.4RT-PCR和qPCR檢測 將剝離的肝臟組織加入Trizol進行勻漿，提取組織RNA，然后按RT-PCR試劑盒說明進行操作，獲得cDNA，按qPCR試劑盒操作說明加入cDNA模板、引物和qPCR mix，通過Bio-red qPCR儀進行檢測。引物序列信息見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用χ2檢驗分析組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qPCR引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 PU-H71對小鼠肝功能的影響

取對照組和PU-H71組小鼠血清進行生化指標(biāo)分析。結(jié)果見表2，在PU-H71的作用下，小鼠血清中AST、ALT的活性明顯低于對照組(P<0.05)；同時，對MDA和SOD活性檢測結(jié)果見表3，PU-H71組血清中MDA活性明顯降低，而SOD活性明顯升高(P<0.05)。

表2 PU-H71對小鼠血清AST和ALT水平的影響

表3 PU-H71對小鼠血清MDA和SOD水平的影響

2.2 肝組織病理學(xué)檢測

為了進一步從形態(tài)學(xué)上確定PU-H71對小鼠肝臟的作用，對肝臟標(biāo)本進行病理學(xué)觀察。對照組肝組織在腫瘤的影響下出現(xiàn)明顯的病變，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肝血竇變窄，肝細胞出現(xiàn)明顯的腫脹壞死，胞漿染色變淡，出現(xiàn)明顯的氣球樣變。損傷嚴重的肝細胞只能見到細胞核，胞質(zhì)透亮。與對照組比較，PU-H71組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)更接近于正常，肝小葉結(jié)構(gòu)相對完整，肝血竇變窄程度較弱，相對清晰可見，肝細胞腫脹程度較輕，未見明顯的氣球樣變。

2.3 PU-H71對血清炎癥因子含量的影響

對照組和PU-H71組小鼠血清進行ELISA檢測，結(jié)果見圖1，相對于對照組，經(jīng)PU-H71處理后，小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α明顯的降低(P<0.05)。

圖1 PU-H71對小鼠血清促炎因子的影響

2.4 PU-H71對肝組織中線粒體自噬相關(guān)基因表達的影響

為了確定PU-H71影響小鼠肝臟的具體機制，對小鼠肝組織中線粒體自噬相關(guān)基因的表達進行分析。結(jié)果見圖2，相對于對照組，PU-H71處理組線粒體自噬相關(guān)基因PINK、Parkin、p62和LC3的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。

圖2 PU-H71對肝臟細胞自噬的調(diào)控作用

3 討論

HSP90作為細胞內(nèi)關(guān)鍵的伴侶分子，占細胞總蛋白的1%-2%[9]。在真核生物細胞中，HSP90能夠與10%的蛋白發(fā)生相互作用，目前發(fā)現(xiàn)大約有700余種蛋白能夠與HSP90發(fā)生蛋白-蛋白直接相互作用，這表明HSP90能夠參與調(diào)控多種生物學(xué)過程，進而影響細胞的生存[10-11]。研究表明，在腫瘤組織中HSP90的表達量要顯著的高于正常組織，以保證腫瘤細胞快速增殖過程中所需蛋白的正確折疊[12-13]。因此，以抑制HSP90為靶點的研究為腫瘤的治療提供了新途徑。但是，抑制HSP90后對肝臟的影響目前尚不明確，有待進一步的研究。

肝臟作為機體藥物代謝和排泄的主要場所，70%左右的藥物需要經(jīng)過肝臟的降解、滅火和轉(zhuǎn)化，或者經(jīng)膽汁進行排泄[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，化療藥物均具有一定的肝臟毒性，例如順鉑能夠造成明顯的肝臟損傷[15]。因此，尋求副作用小，且治療效果好的抗腫瘤藥一直是腫瘤學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。本文研究結(jié)果表明，在持續(xù)給藥2周后，相對于對照組，PU-H71組小鼠血清中肝損傷標(biāo)志物AST和ALT的活性明顯降低(P<0.05)，并且伴隨著MDA活性的降低和SOD活性的升高(P<0.05)，說明PU-H71在抑制腫瘤增殖的情況下，能夠在一定程度上緩解腫瘤對小鼠肝臟的損傷作用。

進一步的組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組在腫瘤的影響下肝組織出現(xiàn)了明顯的病變，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇變窄，肝細胞腫脹壞死。而PU-H71組肝組織結(jié)構(gòu)相對正常，肝血竇變窄程度明顯弱于對照組，肝細胞腫脹程度明顯低于對照組，壞死的肝細胞和氣球樣變相對較少。因此，形態(tài)學(xué)結(jié)果進一步表明PU-H71能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤增殖對肝臟的損傷作用。組織損傷伴隨炎癥反應(yīng)和促炎因子的分泌進一步將炎癥反應(yīng)放大，過度的炎癥反應(yīng)是加重組織損傷的重要原因。本研究結(jié)果表明，PU-H71能夠降低肝組織病變的同時抑制血清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，這可能是PU-H71逆轉(zhuǎn)腫瘤所造成肝損傷的途徑。

肝臟作為機體血液豐富的器官之一，對藥物代謝需要消耗大量的能量，線粒體數(shù)量和功能對于肝臟發(fā)揮正常作用至關(guān)重要[16-18]。而線粒體自噬是細胞清除受損線粒體的主要途徑。本文的結(jié)果表明，相對于對照組，PU-H71處理能夠促進肝組織線粒體自噬相關(guān)基因的表達，能夠有效清除受損線粒體，維持線粒體功能和肝細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。綜上所述，PU-H71在抑制腫瘤的同時，通過調(diào)控線粒體自噬逆轉(zhuǎn)腫瘤對肝臟的損傷作用，為其進一步的臨床試驗提供一定的數(shù)據(jù)支持。