李國澤 李雪 陳藹儀 趙平 楊玲 丁勇

摘要：樟葉越橘是具有重要藥用和經(jīng)濟(jì)價值的特色資源植物，其野生資源日益匱乏，比較其主效成分在組培和野生植物中的含量差異，可為利用組培樟葉越橘大量獲取主效成分提供科學(xué)依據(jù)。應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)測定了樟葉越橘組培與野生植物不同部位中6′-O-咖啡酰熊果苷（6′-O-caffeinylarbutin，CA）、綠原酸和熊果苷3種主效成分含量，并進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，3種主效成分在樟葉越橘組培與野生植物的不種組織部位中的含量存在差異，在成熟葉片和葉芽組織中組培樟葉越橘具有高于野生植物的主效成分含量。各主效成分含量在不同種源樟葉越橘成熟葉片中差異顯著，組培樟葉越橘的CA和綠原酸含量均顯著高于野生植物（P<0.05）。因此繁育的組培樟葉越橘不僅解決了樟葉越橘野生資源匱乏和取材困難問題，還具備了替代野生植物大量提取獲得主效成分的潛能。建議后期可將組培樟葉越橘植物規(guī)?；a(chǎn)并推廣種植。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;樟葉越橘;組培樟葉越橘;野生植物;主效成分

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0175-05

收稿日期：2020-07-28

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31960073、31460076）;云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（編號：51700201）。

作者簡介：李國澤（1994—），女，云南保山人，碩士研究生，主要從事樟葉越橘生物技術(shù)研究。E-mail：2714021549@qq.com。

通信作者：丁 勇，碩士，副教授，主要從事植物生物技術(shù)與分子生物學(xué)研究。E-mail：dingyong@swfu.edu.cn。

樟葉越橘（Vaccinium dunalianum Wight）別稱飯米果（云南昆明）、長尾越橘，是杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生常綠稀攀援灌木[1-2]。樟葉越橘全株可入藥，性味微苦，微溫，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼等多方面的生理功能[3]，是獨(dú)具特色的民族藥物。在云南武定彝族民間因樟葉越橘幼嫩葉芽外形呈錐形，似雀嘴，稱其加工品為雀嘴茶[4]。研究表明，熊果苷、綠原酸以及6′-O-咖啡酰熊果苷（CA）是樟葉越橘的3種主效成分[5]。熊果苷及其衍生物CA具有明顯抑制黑色素生成的皮膚美白活性[6]，可用于化妝品皮膚增白劑[7-9]和黃褐斑的臨床治療[10]。綠原酸具有消炎抗菌[11-12]、抗腫瘤[13-14]、預(yù)防心血管疾病[15-16]等廣泛的生物活性。因此，具有民族藥用資源特色的樟葉越橘植物在食品保健、日用化工以及醫(yī)藥等多個領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

樟葉越橘植物生長慢、分布量有限，又因雀嘴茶生產(chǎn)被連年破壞性采摘，導(dǎo)致其野生資源急劇減少。為解決資源短缺問題，已經(jīng)采用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)開展了樟葉越橘無性繁育工作[17-20]。進(jìn)一步開展樟葉越橘組培馴化植物中主效成分含量及與野生植物中的差異研究，能為以樟葉越橘組培苗為材料開展其主效成分研究及樟葉越橘資源的可持續(xù)開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)保障，而目前此方面工作未見報(bào)道。鑒于此，本研究以樟葉越橘組培和野生植物為材料，應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)測定了不同種源樟葉越橘不同組織部位中熊果苷、綠原酸和CA的含量，并進(jìn)行了含量差異性比較，為開發(fā)樟葉越橘組培馴化植物替代野生植物提取有效活性成分的潛能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用不同組織材料為2019年4月采自樟葉越橘野生和組培樟葉越橘的葉芽、花芽和成熟葉片（表1）。野生植物來源于云南省武定縣新村村、滑坡村和永泉村3個樣點(diǎn)，取生長良好、無病蟲害的鮮新葉芽、花芽和成熟葉片，成熟葉片采樣以枝條頂端葉為第1張葉，在第2～4張葉中任取2張健康成熟的葉片為試驗(yàn)材料，裝入信封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。組培樟葉越橘為課題組前期繁育，按照羅旭璐等的方法[17]進(jìn)行組培初代啟動培養(yǎng)和增殖繼代，培養(yǎng)基分別為木本植物用培養(yǎng)基（WPM）+3.00 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+0.20 mg/L 萘乙酸（NAA）和WPM+2.00 mg/L 玉米素（ZT），培養(yǎng)溫度為 （25±2） ℃，光照度30～50 μmol/（m2·s），每天光照 12 h;按照趙展平等的方法[18]進(jìn)行組培苗生根和移栽馴化，生根培養(yǎng)基為1/4 MS+2.00 mg/L 吲哚乙酸（IBA）+0.10 g/L活性炭+15.00 g/L蔗糖，培養(yǎng)條件同上;移栽馴化基質(zhì)為全腐殖土;后培養(yǎng)在西南林業(yè)大學(xué)樹木園基地，已連續(xù)生長3年，葉芽、花芽和成熟葉片，取樣方法同上。

1.2 試劑

HPLC用甲醇為德國Merck公司產(chǎn)品（色譜純）;提取用甲醇（分析純）和冰乙酸購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;熊果苷和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司（純度 ≥ 98%）;6′-O- 咖啡酰熊果苷（CA）為筆者所在課題組前期從樟葉越橘中提取分離獲得（純度 ≥ 95%）。

1.3 材料預(yù)處理

將試驗(yàn)樣品裝在鋁質(zhì)干燥盒中放于理化干燥箱（LG100B，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）中45 ℃恒溫干燥至恒質(zhì)量（SOP型電子分析天平，德國Sartorius公司，前后2次稱量差異在5‰以內(nèi)），放入高速萬能粉碎機(jī)中粉碎（過40目篩），密封于50 mL離心管中裝好。測定前，將樣品置于干燥器中平衡過夜。

1.4 HPLC色譜條件

參照文獻(xiàn)[21]，HPLC色譜柱為F90104 CAPCELL PAK C18 MG （S-5）（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A和B分別為1%冰乙酸和甲醇（預(yù)處理：流動相于超聲波清洗器上超聲19 min，去除流動相中的氣泡以避免損壞液相色譜儀和色譜柱），流速1 mL/min，梯度洗脫條件：0～<10 min，95%A，5%B;10～<50 min，85%A，15%B;50～<55 min，35%A，65%B;55～<70 min，5%A，95%B;≥70 min，95%A，5%B。柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，進(jìn)樣體積10 μL。

1.5 HPLC標(biāo)準(zhǔn)品制備

分別精確稱取熊果苷、CA及綠原酸3種標(biāo)準(zhǔn)品，配制成起始質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL熊果苷、3.00 mg/mL綠原酸以及6.00 mg/mL CA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次等體積稀釋6次，最終稀釋為終濃度0.02 mg/mL熊果苷、0.05 mg/mL綠原酸以及 0.09 mg/mL CA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過濾（0.45 μm濾孔濾膜）后注入液相色譜瓶中，按“1.4”節(jié)的色譜條件在高效液相色譜儀（Waters 2695，美國Waters公司）進(jìn)行HPLC分析檢測，建立3種主效成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取不同質(zhì)量濃度熊果苷、綠原酸、CA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下依次進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），計(jì)算線性回歸方程。

1.7 樣品含量測定

參照文獻(xiàn)[22] 的提取主效成分方法，精確稱取粉碎樣品0.10 g，3個重復(fù)。73%甲醇超聲19 min（LU10AT型超聲波清洗儀，上海冠特超聲儀器有限公司），料液比1 g ∶16 mL，5 000 r/min離心2 min（CF16RXⅡ臺式高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司），提取4次，各取1 mL上清提取液等體積混勻，過0.45 μm濾孔濾膜后注入棕色色譜小瓶，濾液以進(jìn)樣體積10 μL分別進(jìn)樣，記錄各供試樣品中3種主效成分的色譜出峰面積，分別代入線性回歸方程，計(jì)算其在不同組織樣品中的含量。

1.8 分析方法

運(yùn)用Excel 2010統(tǒng)計(jì)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析（LSD法和Duncans法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，CA回歸方程為y=9×106x+1 328.1，r2=0.999 8;綠原酸回歸方程為y=1×107x-437 086，r2=0.999 3;熊果苷回歸方程為y=4×106x+10 088，r2=0.999 8。標(biāo)準(zhǔn)品CA、綠原酸、熊果苷分別在0.90～60.00、0.50～30.00、0.20～6.00 μg范圍內(nèi)，r2均大于0.999，線性關(guān)系良好。

2.2 樟葉越橘組培與野生植物不同部位中主效成分含量比較

表2為樟葉越橘組培與野生植物成熟葉片、葉芽和花芽3種組織中CA、綠原酸和熊果苷3種主效成分含量?？梢钥闯?，組培樟葉越橘成熟葉片的3種主效成分含量均顯著高于野生樟葉越橘（P<0.05），組培樟葉越橘的CA、綠原酸和熊果苷含量分別是野生樟葉越橘2.55倍、2.84倍、2.27倍。葉芽中CA和熊果苷含量也表現(xiàn)為組培樟葉越橘顯著高于野生樟葉越橘，組培樟葉越橘CA和熊果苷含量分別是野生樟葉越橘1.30倍、1.23倍;組培和野生樟葉越橘葉芽中綠原酸含量則沒有顯著性差異。組培樟葉越橘花芽中3種主效成分含量顯著低于野生樟葉越橘，組培樟葉越橘的CA、綠原酸和熊果苷含量只有野生樟葉越橘的69.77%、76.70%和70.31%。說明組培與野生樟葉越橘的不同組織部位中3種主效成分含量存在較大的差異，組培樟葉越橘的成熟葉片和葉芽組織的主效成分含量高于野生樟葉越橘（葉芽組織的綠原酸含量除外），而野生樟葉越橘花芽組織的主效成分含量卻高于組培樟葉越橘。

由圖1可知，3種主效成分含量在組培和野生樟葉越橘不同組織中均表現(xiàn)為CA>綠原酸>熊果苷，且差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。但同一成分的組織含量分布特征在組培和野生樟葉越橘中

存在差異（表2）。組培樟葉越橘中，葉芽（LB-SWFU）的CA含量顯著高于成熟葉片（ML-SWFU）和花芽（FB-SWFU），后2種組織中則無顯著差異;綠原酸在成熟葉片（ML-SWFU）中的含量顯著高于葉芽（LB-SWFU）和花芽（FB-SWFU），后2種組織差異顯著;熊果苷在葉芽（LB-SWFU）中的含量顯著高于花芽（FB-SWFU），后者又顯著高于成熟葉片（ML-SWFU）。而野生植物中CA、綠原酸和熊果苷在組織含量分布上均表現(xiàn)為花芽（FB-XC）>葉芽（LB-XC）>成熟葉片（ML-XC），且差異顯著（表2）。

2.3 不同種源樟葉越橘成熟葉片中主效成分含量比較

通過以上對組培與野生樟葉越橘不同部位中主效成分含量比較發(fā)現(xiàn)，組培樟葉越橘成熟葉片中3種主效成分含量較高，且顯著高于野生樟葉越橘成熟葉片。植物葉片資源量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于葉芽和花芽，因此，本研究繼續(xù)比較了不同種源樟葉越橘（包括1個組培樟葉越橘試樣和3個不同地點(diǎn)的野生植物試樣）成熟葉片中3種主效成分含量（表3）。由表3可知，不同樣品中CA和綠原酸含量高低順序分別為ML-SWFU>ML-YQ>ML-HP>ML-XC和ML-SWFU>ML-YQ>ML-XC>ML-HP，熊果苷含量表現(xiàn)為ML-YQ>ML-HP>ML-SWFU>ML-XC，均差異顯著。各主效成分在不同種源樟葉越橘成熟葉片中的含量均存在顯著差異;組培樟葉越橘成熟葉片中CA和綠原酸含量均顯著高于野生樟葉越橘，熊果苷的含量處于不同種源野生樟葉越橘的中間水平。另外，不同種源樟葉越橘成熟葉片中3種主效成分含量均符合CA>綠原酸> 熊果苷的規(guī)律（圖2）。表明組培樟葉越橘成熟葉片中富集的主效成分含量能夠達(dá)到甚至超過野生樟葉越橘的水平。

3 討論與結(jié)論

富含CA、綠原酸和熊果苷3種主效成分的新興、健康特殊民族資源植物樟葉越橘已被報(bào)道具有重要的藥用[23-26]和經(jīng)濟(jì)[5-9，27]價值，隨著對其開發(fā)利用的研究增多，其野生資源也日益緊張。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可在不破壞野生資源的前提下為研究者帶來大量無性繁殖植物，且具有不受地理、季節(jié)和氣候等條件限制的優(yōu)勢[28]。在已經(jīng)開展樟葉越橘組培體系建立[17]和培育獲得組培樟葉越橘[18]的研究下，本試驗(yàn)比較了組培與野生樟葉越橘不同組織部位中3種主效成分含量，結(jié)果表明，組培樟葉越橘在成熟葉片和葉芽組織中具有高于野生樟葉越橘的主效成分含量，尤其是CA和綠原酸在組培樟葉越橘成熟葉片中的含量均顯著高于野生樟葉越橘。CA和綠原酸是野生樟葉越橘中含量最高的2種主效成分[5，29]。因此，組培樟葉越橘不僅解決了野生植物取材困難、資源匱乏等問題，還具備了替代野生植物可大量提取獲得主效成分的潛能。

已知文獻(xiàn)報(bào)道，野生樟葉越橘3種主效成分含量高低順序在各組織中均表現(xiàn)為CA>綠原酸>熊果苷[21，29]。本研究中組培和不同種源野生樟葉越橘各組織中也呈現(xiàn)同樣的規(guī)律，但3種主效成分的組織含量分布特征在組培和野生樟葉越橘中存在較大差異。本研究中，CA、綠原酸和熊果苷在野生樟葉越橘組織含量分布上均表現(xiàn)為花芽>葉芽>成熟葉片，這不同于以往文獻(xiàn)顯示的葉芽>花芽>成熟葉片的結(jié)果報(bào)道[21，29]，且化合物具體含量值也存在較大差異，推測這可能與植物樣品種源[30-34]和干燥方式[35-38]、化合物提取工藝和檢測方式[22，39-41]等因素不同有關(guān)。組培樟葉越橘中，熊果苷的組織含量分布與文獻(xiàn)[21，29]報(bào)道的一致，為葉芽>花芽>成熟葉片;而CA和綠原酸的組織含量分布特征則不同于以上規(guī)律，CA在葉芽中的含量顯著高于成熟葉片和花芽的，后兩者無顯著差異;綠原酸在成熟葉片中的含量顯著高于葉芽和花芽，后兩者也無顯著差異。隨著CA、綠原酸、熊果苷等化合物的需求范圍不斷擴(kuò)大，對其不僅有高含量提取的要求，而且提取工藝和檢測方法等既要節(jié)約資源，又要準(zhǔn)確簡便。因此，建立樟葉越橘主效成分含量提取鑒定方式的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)是后期研究努力的一個方向。

綜上所述，樟葉越橘CA、綠原酸、熊果苷3種主效成分含量因種源和組織部位不同而存在差異。在成熟葉片和葉芽組織中，組培樟葉越橘的成熟葉片和葉芽組織的主效成分含量高于野生樟葉越橘（葉芽組織的綠原酸含量除外）。不同種源樟葉越橘成熟葉片中各主效成分含量差異顯著，組培樟葉越橘的CA和綠原酸含量均顯著高于野生樟葉越橘。因此，可通過規(guī)?；庇寥~越橘組培樟葉越橘替代其野生植物大量提取主效成分，從而解決樟葉越橘在開發(fā)利用過程中存在的野生資源匱乏和取材困難等問題。

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