崔廷婷 萬宇平陳立軍崔娜崔海峰吳小勝

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 灤州 063701)

三唑酮是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，兼有保護、治療、鏟除和熏蒸等作用，可用于防治小麥的紋枯病、全蝕病、白粉病、根腐病，水稻的稻瘟病、稻葉尖枯病、稻曲病、黑粉病等多種病害[1]。其還是一種甾醇抑制劑和植物生長調(diào)節(jié)劑，在與一些農(nóng)藥混配后具有協(xié)同增效作用[2]。但大量使用該農(nóng)藥，會導(dǎo)致部分產(chǎn)地農(nóng)作物中三唑酮檢出率偏高，殘留在農(nóng)產(chǎn)品中的三唑酮會對人體產(chǎn)生危害[3,4]，也會影響我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和出口貿(mào)易[5]。因此，三唑酮及其代謝物三唑醇在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留檢測受到了越來越多的關(guān)注。

目前，關(guān)于三唑酮及其代謝物三唑醇的殘留檢測方法多為氣相色譜法[6-8]、液相色譜法[9]和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10-13]。這些方法可以精確地進行定量分析，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，檢測成本高、周期長，而且需要專業(yè)的人員，只能用于小批量樣品抽檢，無法滿足對大批量樣品進行現(xiàn)場、快速檢測的需要。而酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)具有特異性高、敏感性強、快速方便、不需要昂貴儀器設(shè)備、檢測成本低、適合于大批量樣品的檢測等優(yōu)點，已在農(nóng)獸藥殘留及微量毒素檢測中被廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬建立一種快速、靈敏檢測煙草、蔬菜水果中三唑酮及其代謝物殘留的酶聯(lián)免疫吸附方法，旨在為農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠(6～8周齡)，清潔級，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司實驗動物室提供；1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳化二亞胺(EDC)、三唑酮、三唑醇(純度≥99%)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)均購自Sigma公司；其它化學(xué)試劑為分析純。復(fù)溶液為pH7.0、0.1mol·L-1的磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設(shè)備

8010S勻漿機，上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；2000SBL電子天平，美國Setra公司；QL-901漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Anke TDL-40B低速離心機，海安亭科學(xué)儀器有限公司；微量移液器(單道20～200μL、100～1000μL，多道20～300μL)，美國Thermo公司；DHP-600生化培養(yǎng)箱，天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；MK3酶標儀，美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 三唑酮半抗原的合成

合成路線見圖1。取1.0g三唑酮加乙醇溶解，加入0.35g DBU，攪拌，再加入0.87g氨基己酸水溶液，加熱回流反應(yīng)12h；停止反應(yīng)，旋蒸，除去乙醇，加水和1.3g氫氧化鉀，震蕩，加乙酸乙酯萃取，分去有機相，水相調(diào)節(jié)pH值到4，加乙酸乙酯萃取，有機相水洗，無水硫酸鈉干燥蒸干，得到淺黃色油狀物，二氯甲烷/石油醚(1∶10，V/V)重結(jié)晶，即得到三唑酮半抗原產(chǎn)物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振鑒定。

1.3.2 人工抗原的制備

將三唑酮半抗原與BSA和OVA分別偶聯(lián)，作為免疫原和包被原。具體操作過程：取14mg半抗原，溶解于1mL DMF中；稱取載體蛋白50mg，使之充分溶解在3.8mL MES緩沖液(pH5.0)中，將半抗原緩慢滴加到蛋白溶液中；取30mg EDC用0.2mL MES緩沖液(pH5.0)充分溶解后加入半抗原蛋白混合液中，室溫下攪拌24h；用0.01mol·L-1PBS緩沖液4℃透析3d，每天換3次透析液；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 單克隆抗體的制備

按照常規(guī)方法免疫Balb/c小鼠制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用[14]。

1.3.4 抗原、抗體最適工作濃度的確定

分別將包被原(三唑酮半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物)和三唑酮單克隆抗體溶液倍比稀釋，進行間接競爭ELISA方陣試驗，選取OD450nm值在1.0左右的包被原和抗體濃度為最佳工作濃度。

1.3.5 間接競爭ELISA方法的建立

用包被緩沖液將包被原稀釋成最佳工作濃度后，包被在96孔酶標板上，100μL/孔，37℃溫育2h；傾去板中溶液，經(jīng)PBST洗滌3次，加入封閉液200μL/孔，37℃溫育2h；洗滌3次，加入系列濃度的三唑酮標準溶液50μL/孔，再加入經(jīng)抗體稀釋液稀釋成最佳工作濃度的單克隆抗體溶液50μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后，加入酶標二抗100μL/孔，25℃避光反應(yīng)30min；洗滌4～5次后加入底物液A液(過氧化脲)和B液(四甲基聯(lián)苯胺)各50μL/孔，25℃顯色15min，加入2mol·L-1H2SO4終止液50μL/孔，設(shè)定酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值(OD值)。

信貸扶貧資金管理方面主要的創(chuàng)新有：第一，借款主體的創(chuàng)新，先后嘗試了直接貸款到戶、扶持經(jīng)濟實體、支持地方主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和龍頭企業(yè)，以及直接貸款到戶與委托幫扶貸款相結(jié)合等方式；第二，貸款方式創(chuàng)新，1986年以來嘗試了政府信用下的經(jīng)濟實體貸款、依托社會信用的小額貸款、抵押和擔保為基礎(chǔ)的企業(yè)或政府貸款等；第三，貼息方式創(chuàng)新，嘗試了貼息給承貸銀行、貼息給借款人等方式；第四，承貸機構(gòu)選擇，先后嘗試了商業(yè)銀行承貸、政策銀行承貸、地方政府選擇等方式。

1.3.6 標準曲線的繪制

采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇三唑酮標準品濃度0μg·L-1、1μg·L-1、3μg·L-1、9μg·L-1、27μg·L-1、81μg·L-1，以濃度為0μg·L-1時的OD值為B0值，相應(yīng)三唑酮濃度的OD值為B值，以百分吸光度值(B/B0)為縱坐標，標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.7 樣品前處理

1.3.7.1 煙草樣本

稱取1±0.05g均質(zhì)的煙草樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL乙腈，渦動3min混勻；4000r·min-1室溫離心5min；取20μL樣本液至4mL聚苯乙烯離心管中，加入1980μL復(fù)溶液，渦動30s，取50μL用于分析。

1.3.7.2 蔬菜水果樣本

稱取1±0.05g均質(zhì)的果蔬樣本至10mL聚苯乙烯離心管中，加入4mL乙腈，渦動3min混勻；4000r·min-1室溫離心5min；取20μL樣本液至4mL聚苯乙烯離心管中，加入1980μL復(fù)溶液，渦動30s，取50μL用于分析。

1.3.8 酶聯(lián)免疫方法技術(shù)參數(shù)的確定

1.3.8.1 檢測限試驗

1.3.8.2 特異性試驗

選擇與三唑酮具有類似結(jié)構(gòu)和類似功能的其它殺菌劑(三唑醇、環(huán)唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇)進行交叉反應(yīng)性檢測。計算交叉反應(yīng)率：

交叉反應(yīng)率=X/Y×100%

式中，X為引起50%抑制的三唑酮濃度；Y為引起50%抑制的其它殺菌劑濃度。

1.3.8.3 準確性和重復(fù)性試驗

用回收率和變異系數(shù)分別來評價ELISA方法的準確性和重復(fù)性。以3個不同濃度的三唑酮、三唑醇標準品分別對空白樣本進行添加回收試驗，計算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的核磁共振氫譜鑒定

取半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁共振得圖2。從圖2可知，1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：11.00(1H,s)，7.51(1H,ddd,J=8.132,J=5.483,J=1.670)，7.46(1H,ddd,J=8.132,J=5.485,J=1.670)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.485)，6.94(1H,dd,J=8.132,J=5.483)，6.52(1H)，8.270(1H,d,J=1.903)，8.1(1H,d,J=1.903)，3.87(2H,t,J=7.434)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.25(3H,s)，1.84(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.41(2H,tt,J=7.434,J=7.022)，1.55(2H,tt,J=7.434,J=7.367)，2.30(2H,t,J=7.367)。圖譜中，化學(xué)位移δ=11.0的為間隔臂上羧基氫共振吸收峰；δ=1.85、1.41、2.30的為間隔臂上亞甲基氫的共振吸收峰，這些峰的存在，證明間隔臂偶聯(lián)成功，三唑酮半抗原結(jié)構(gòu)正確。

2.2 最佳工作濃度的選擇

方陣法測定不同包被原和單克隆抗體的間接競爭抑制ELISA測定結(jié)果(OD450nm值)見表1。在ELISA包被過程中，包被效果與濃度呈正相關(guān)，但濃度過高，不僅浪費試劑，而且會降低待測物的競爭能力，從而影響靈敏度[16]。考慮到酶標儀測定OD450nm值的敏感范圍在1.00左右，為了既保證測定結(jié)果的靈敏可靠，又減少抗原的用量，試驗應(yīng)選擇的最適包被原稀釋倍數(shù)為1∶10000，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶300000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450nm值

2.3 標準曲線的建立

以百分吸光度值(B/B0)為縱坐標(Y)，標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標(X)繪制標準曲線，如圖3所示。以Logit(B/B0)為縱坐標，標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，將圖3轉(zhuǎn)換后可知，在1～81μg·L-1濃度范圍內(nèi)，Logit(B/B0)與三唑酮濃度對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，如圖4所示。建立擬合回歸直線方程為Y=-2.175X+1.086，相關(guān)系數(shù)r為0.9950，半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.0μg·L-1。

2.4 檢測限測定

20個空白樣本的B/B0在標準曲線上對應(yīng)的濃度見表2，綜合考慮幾種樣本的檢測限數(shù)據(jù)，得出本方法對煙草和蔬菜水果樣本的檢測限為0.5mg·kg-1。

表2 方法的檢測限測定結(jié)果

2.5 特異性測定

由于三唑醇是三唑酮的代謝產(chǎn)物，所以選用的三唑酮單克隆抗體與三唑醇有94.6%的交叉反應(yīng)，而與其它類似結(jié)構(gòu)的殺菌劑的交叉反應(yīng)均<1%，說明該方法具有良好的特異性。

2.6 準確性和重復(fù)性測定

ELISA測定的準確度用回收率表示，精密度用變異系數(shù)表示。以市售空白煙葉、白菜、茄子、蘋果、香蕉樣本為試驗材料，向其中分別添加三唑酮及其代謝物三唑醇標準品，添加量為0.5mg·kg-1、1.0mg·kg-1、2.0mg·kg-1。結(jié)果表明，樣品加標回收率為73.6%～102.5%，重復(fù)檢測結(jié)果的變異系數(shù)為5.8%～9.2%，說明該ELISA方法測定煙草、蔬菜水果中三唑酮及其代謝物三唑醇殘留具有良好的準確性和重復(fù)性，可用于農(nóng)作物中三唑酮及其代謝物三唑醇的殘留檢測。

3 結(jié)論

酶聯(lián)免疫法因靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低、一次性檢測樣本量大等特點，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府監(jiān)管部門等開展檢測工作。本研究初步建立了煙草和蔬菜水果中三唑酮及其代謝物三唑醇殘留檢測的酶聯(lián)免疫吸附法。該方法的IC50為3.0μg·L-1，樣本檢測限為0.5mg·kg-1；陽性樣本的加標回收率為73.6%～102.5%，樣本重復(fù)檢測結(jié)果的變異系數(shù)為5.8%～9.2%，并且樣本前處理簡單、儀器設(shè)備投資少、檢測成本低，適用于大批量樣本中三唑酮及其代謝物三唑醇殘留的快速篩選。