Bacillus sp. Y112環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)R81定點(diǎn)突變提高產(chǎn)物特異性

李曉涵，郭姣梅，宋 凱，孫晶晶，王 偉，郝建華,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.海洋藥物與生物制品實(shí)驗(yàn)室，青島國(guó)家海洋科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase）屬于糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）[1]。CGTase能夠催化包括環(huán)化、水解、偶聯(lián)和歧化在內(nèi)的4 種反應(yīng)，其中環(huán)化反應(yīng)是特征性反應(yīng)，該反應(yīng)可以以淀粉類(lèi)基質(zhì)作底物合成環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）。目前，酶法合成是工業(yè)生產(chǎn)CD的主要方法。常見(jiàn)的CD包括α-CD、β-CD和γ-CD，分別通過(guò)α-1,4糖苷鍵連接的6、7 個(gè)和8 個(gè)葡萄糖單元組成[2]。CD分子具有外部親水性和內(nèi)部疏水性，其疏水性空腔可以包裹疏水性分子或基團(tuán)形成包合物，改變被包埋物的物理及化學(xué)性質(zhì)[3]，因此在食品、藥品和化妝品等方面有著廣泛的應(yīng)用[4]。

基于酶蛋白的同源建?；蚓w結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)突變是一種改善酶催化活性及酶學(xué)性質(zhì)的有效方法[5-7]。近年來(lái)，定點(diǎn)突變技術(shù)已被多次應(yīng)用于改善CGTase的產(chǎn)物特異性[8]。將來(lái)自Paenibacillussp. 602-1的α-CGTase第195位點(diǎn)處的酪氨酸替換為精氨酸和賴(lài)氨酸的后，主要CD產(chǎn)物由α-CD變?yōu)棣?CD。其中突變體Y195I極大改變了產(chǎn)物特異性，催化生成的CD中β-CD和γ-CD所占比例比分別為34%和38%[9]。用谷氨酸和精氨酸取代來(lái)源于Bacillus circulansSTB01的CGTase中第577位的天冬氨酸，結(jié)果表明這2 種突變體都顯著提高了β-環(huán)化活性，特別是變體D577R，其β-環(huán)化活力增加了30.7%[10]。郭永華等[11]對(duì)淀粉結(jié)合位點(diǎn)2第623位天冬氨酸進(jìn)行飽和誘變，得到突變體N623T的總環(huán)化活力與原始酶比提高了58.6%。

CGTase包含A、B、C、D、E 5 個(gè)結(jié)構(gòu)域，A結(jié)構(gòu)域具有催化活性，B結(jié)構(gòu)域有一個(gè)位于酶蛋白表面的凹槽，凹槽周?chē)囊恍┌被釟埢軌蚺c底物發(fā)生作用，使底物有效結(jié)合到酶蛋白上，因此該區(qū)域稱(chēng)為底物結(jié)合域。在底物結(jié)合凹槽內(nèi)有9 個(gè)糖基結(jié)合亞位點(diǎn)，標(biāo)記為+2～-7[12]，每個(gè)亞位點(diǎn)都可以結(jié)合一個(gè)葡萄糖殘基。本實(shí)驗(yàn)對(duì)來(lái)源于Bacillussp. Y112的CGTase-3亞位點(diǎn)附近第81位的精氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建一種能夠提高β-CD產(chǎn)物專(zhuān)一性的突變體R81T，并進(jìn)一步純化野生型和突變體CGTase用于比對(duì)其在催化活性、產(chǎn)物特異性及酶學(xué)性質(zhì)方面的差異，旨在獲得產(chǎn)物特異性高的優(yōu)勢(shì)酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含CGTase基因的原始菌株Bacillussp. Y112由實(shí)驗(yàn)室篩選得到；重組質(zhì)粒pET24a/cgt由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）、DH5α 北京博邁德公司；pET24a 德國(guó)Novagen公司；BCA蛋白定量試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒 北京天根生化科技有限公司；Q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖?美國(guó)NEB公司；Ni2+親和層析柱 美國(guó)GE公司；zorbax NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國(guó)安捷倫公司；乙腈（色譜純） 德國(guó)Sigma公司；引物合成和DNA測(cè)序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

定性梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)Biometra公司；GI54DS高壓蒸汽滅菌鍋 廈門(mén)致微儀器有限公司；JY96-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科技生物股份有限公司；Bio-Rad MiniIII蛋白電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；DC-2006低溫恒溫槽 上海比朗儀器公司；AKTA快速液相色譜儀美國(guó)通用電氣公司；Infinite M200Pro多功能微孔板檢測(cè)儀 瑞士Tecan公司；高效液相色譜系統(tǒng)（配有RID-20A示差檢測(cè)器） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及定點(diǎn)突變

對(duì)CGTase的第81位氨基酸序列AGA進(jìn)行定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)，正向引物為CTTAACAA AATATTGTGGTGGAGATTGGCAAGG，反向引物為T(mén)TTTTACAATCCTCCGAATAAAGT TCTCCTGATGGG。用Q5定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?duì)R81位點(diǎn)進(jìn)行PCR。PCR體系：Q5 Hot Start High-Fidelity 2×Master Mix 12.5 μL、Forward Primer（10 μmol/L）1.25 μL、Reverse Primer（10 μmol/L）1.25 μL、Template DNA（10 ng）1 μL、Nuclease-free water 9 μL；PCR條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行環(huán)化和模板去除反應(yīng)，將擴(kuò)增產(chǎn)物直接加入到Kinase-Ligase-DpnI酶混合液中，室溫條件下放置5 min后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃放置過(guò)夜，挑取平板單菌落測(cè)序。測(cè)序正確的突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃放置過(guò)夜，挑取單菌落保菌。

1.3.2 蛋白表達(dá)與純化

將保菌的甘油菌按1%接種量接種到5 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB試管，37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液。再將種子液以2%接種量接種到150 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm在0.6左右[13]，加入終濃度0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG），20 ℃誘導(dǎo)18 h。誘導(dǎo)結(jié)束后9 000 r/min離心10 min收集菌體，用10 mL的pH 8.0的磷酸鹽緩沖液重懸菌體后在冰浴中超聲破碎，然后8 000 r/min離心60 min后取上清液制成粗酶液。

粗酶液過(guò)鎳柱純化[14]，上樣后先用A液（20 mmol/L磷酸緩沖液，500 mmol/L氯化鈉，pH 8.0）洗脫，待穿透峰跑平后用5%的B液（20 mmol/L磷酸緩沖液，500 mmol/L氯化鈉，500 mmol/L咪唑，pH 8.0）洗脫雜蛋白。待雜蛋白洗脫峰跑平后用20%的B液洗脫目的蛋白CGTase。

1.3.3 酶活力測(cè)定

參考Jemli等[15]方法測(cè)定酶活力。0.2 mL 0.2 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9）中加入10 μL酶液，再加入0.2 mL 0.2%可溶性淀粉溶液，40 ℃水浴反應(yīng)10 min后加入0.5 mL 0.5 mol/L醋酸溶液終止反應(yīng)，再加入3 mL 0.005%碘液顯色。以不加淀粉溶液為空白組，不加酶液為對(duì)照組。在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度下降10%的酶量定為1 個(gè)單位。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：a為對(duì)照減去空白的吸光度差值；b為樣品減去空白的吸光度差值。

1.3.4 蛋白表達(dá)電泳驗(yàn)證和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的粗酶液以及鎳柱純化后的酶液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗(yàn)證蛋白表達(dá)及純化效果。用BCA試劑盒對(duì)純化后的蛋白含量進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.3.5 CD產(chǎn)物特異性分析

取1 mL 1%可溶性淀粉溶液，加入1 mL的適當(dāng)稀釋的酶液（100 U），總反應(yīng)體積為2 mL。40 ℃水浴反應(yīng)，每隔10 min取200 μL反應(yīng)液，煮沸滅活10 min。滅活后的反應(yīng)液過(guò)0.22 μm濾膜后取20 μL進(jìn)行高效液相色譜分析。洗脫液為70%乙腈溶液，洗脫速率為1 mL/min，柱溫箱溫度為30 ℃。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)的對(duì)比

用不同pH值（pH 4.0～12.0）緩沖液測(cè)定大腸桿菌表達(dá)的原始酶和突變酶的最佳pH值。緩沖液種類(lèi)分別為：檸檬酸緩沖液（pH 4.0～5.0）、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.0～8.0）、Gly-NaOH緩沖液（pH 8.6）和Na2HPO4-NaOH緩沖液（pH 10.0～12.0）[16]，所用緩沖液pH值均在25 ℃測(cè)定。將原始酶和突變酶的酶液在上述各種緩沖液中于4 ℃溫育12 h后測(cè)定剩余活力，對(duì)比2 種酶的pH值穩(wěn)定性。在30～60 ℃范圍內(nèi)，測(cè)定原始酶和突變酶的最佳反應(yīng)溫度。將2 種酶溶液在10～60 ℃條件下溫育12 h后測(cè)定剩余活力，對(duì)比2 種酶的熱穩(wěn)定性。酶活力測(cè)定方法參照1.3.3節(jié)。

1.3.7 同源模建與氨基酸序列比對(duì)

采用Swiss-Model（http://swissmodel.expasy.org）網(wǎng)站對(duì)CGTase進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，并通過(guò)pyMOL對(duì)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析以及構(gòu)建說(shuō)明性圖形。使用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制均利用Microsoft Office Excel 2007完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 定點(diǎn)突變位點(diǎn)的選擇

圖1 帶有γ-CD的原始CGTase的活性凹槽Fig.1 Active groove structure of the wild-type CGTase with γ-CD

同源建模得到的CGTase三維結(jié)構(gòu)（圖1）顯示R81位于底物結(jié)合的活性凹槽。通過(guò)比對(duì)已知的CD酶蛋白結(jié)構(gòu)確定了該位點(diǎn)位于-3亞位點(diǎn)附近。有研究[18-19]表明對(duì)CGTase底物結(jié)合亞位點(diǎn)周?chē)陌被徇M(jìn)行定點(diǎn)突變可以影響環(huán)化活力和產(chǎn)物特異性，其中-6和-3底物結(jié)合亞位點(diǎn)在環(huán)化反應(yīng)中起重要作用[8]。

圖2 α-、β-和γ-CGTase序列對(duì)比Fig.2 Sequence alignment among α-, β- and γ-CGTases

對(duì)Bacillussp. Y112的CGTase與Paenibacillussp. 602-1[20]的α-CGTase、Bacillus circulans251的β-CGTase[21]、Bacillussp. G-825-6的γ-CGTase[22]的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖2）可以發(fā)現(xiàn)，各種CGTase氨基酸序列中大部分氨基酸序列高度保守，其中γ-CGTase與其他2 種CGTase的相似程度較低。紅色框中圈出的氨基酸位點(diǎn)為Bacillussp.Y112 CGTase的第81位氨基酸位點(diǎn)，此位點(diǎn)在α-CGTase中為賴(lài)氨酸，在β-CGTase中為精氨酸，在γ-CGTase中為蘇氨酸。在α-CGTase和β-CGTase第81位點(diǎn)處的氨基酸雖然不同，分別為精氨酸和賴(lài)氨酸，但2 種氨基酸性質(zhì)相似，都屬于堿性氨基酸，且結(jié)構(gòu)相似。而蘇氨酸屬于酸性氨基酸，且側(cè)鏈較小[23]。所以推測(cè)將Bacillussp. Y112 CGTase第81位的精氨酸突變?yōu)樘K氨酸可能傾向于產(chǎn)生較大的CD產(chǎn)物。

2.2 氫鍵比較

研究表明[24]，氫鍵作用的改變可以影響酶的催化作用及底物的結(jié)合。圖3為原始酶和突變酶第81位氨基酸殘基的三維結(jié)構(gòu)，標(biāo)出了可能與該位點(diǎn)有氫鍵作用的氨基酸以及結(jié)合底物，由圖3A可以看出，突變前的R81位點(diǎn)與氨基酸殘基N79、T128有氫鍵作用，由于氨基酸側(cè)鏈較長(zhǎng)，還顯示出與較遠(yuǎn)氨基酸殘基D402和結(jié)合底物的氫鍵作用。突變后， R81T位點(diǎn)與周?chē)被岬臍滏I作用力有所改變，與D402的氫鍵作用力消失，增加了與G126位點(diǎn)的氫鍵作用力。圖3還顯示出，突變前R81位點(diǎn)的精氨酸與底物有氫鍵作用，該位點(diǎn)突變?yōu)樘K氨酸后，由于氨基酸側(cè)鏈變短，氫鍵與底物的作用力消失。氫鍵作用力的改變會(huì)對(duì)CGTase的環(huán)化作用產(chǎn)生影響[11]。Xie Ting等[9]的研究結(jié)果表明，當(dāng)突變氨基酸的側(cè)鏈不通過(guò)氫鍵與底物相互作用時(shí)，突變體傾向于形成更大的CD。側(cè)鏈長(zhǎng)度較短的氨基酸也可以加大底物結(jié)合凹槽的作用空間，有利于生成較大的CD產(chǎn)物。說(shuō)明側(cè)鏈大小和環(huán)化作用之間有一定的相關(guān)性。凌凱等[25]研究結(jié)果表明用側(cè)鏈較短的氨基酸替換CGTase第48位點(diǎn)處的氨基酸能有效提高γ-CD的生成量。

圖3 原始酶（A）和突變酶（B）第81位氨基酸與周?chē)被崤cγ-CD底物分子之間的氫鍵作用力Fig.3 Hydrogen bonding interaction of the amino acid residue 81 of wild-type (A) and mutant (B) CGTases with surrounding amino acid residues and substrate molecules

2.3 蛋白表達(dá)與純化

圖4 純化后的原始酶及突變酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified wild-type and mutant CGTases

通過(guò)SDS-PAGE驗(yàn)證鎳柱純化得到的原始酶與突變酶的蛋白純度，結(jié)果如圖4所示。在75 kDa處顯示為單一條帶，達(dá)到電泳純。測(cè)定純化后的2 種酶的蛋白質(zhì)量濃度及比活力，表1結(jié)果表明，與原始酶相比，突變酶的蛋白表達(dá)量及比活力沒(méi)有明顯降低。

表1 原始酶與突變酶比活力Table 1 Specific activity of wild-type and mutant CGTases

2.4 產(chǎn)物特異性分析

以1%的可溶性淀粉為反應(yīng)底物分別與原始酶和突變酶反應(yīng)，分析α、β和γ三種CD產(chǎn)物的生成量。如圖5所示，2 種酶的主要產(chǎn)物均為β-CD，其產(chǎn)量在70 min到達(dá)最高，約為1.1 g/L，隨后呈下降趨勢(shì)。與原始酶相比，突變酶的α-CD產(chǎn)量下降明顯，γ-CD在0～50 min內(nèi)的生成量也有較明顯的提高。計(jì)算反應(yīng)70 min各種CD產(chǎn)物的所占比例及淀粉轉(zhuǎn)化率（表2）可以看出，2 種酶的淀粉總環(huán)化率相差無(wú)幾，α-CD所占產(chǎn)物比例降低8%，β-CD所占產(chǎn)物比例提高7%。說(shuō)明用蘇氨酸替代R81位點(diǎn)的精氨酸確實(shí)能夠提高較大CD的生成率。

表2 原始酶與突變酶淀粉轉(zhuǎn)化率Table 2 Conversion efficiency of soluble starch into cyclodextrins by wild-type and mutant CGTases

2.5 pH值和溫度對(duì)酶活力的影響

在20～70 ℃的范圍內(nèi)測(cè)定原始酶和突變酶的最適反應(yīng)溫度，通過(guò)圖6a可以看出，2 種酶均在50 ℃活力最高，在45～55 ℃范圍酶活力保持在80%以上，且在60 ℃的高溫下反應(yīng)仍保留了60%以上活力。通過(guò)圖6b可以看出，突變酶和原始酶在0～30 ℃放置12 h后仍保持了80%以上的熱穩(wěn)定性。且在20～30 ℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出最好的熱穩(wěn)定性。說(shuō)明原始酶和突變酶均為嗜熱酶，且可以常溫貯存。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明第81位精氨酸突變?yōu)樘K氨酸后，突變體保留了原始酶良好的嗜熱性及熱穩(wěn)定性。

圖6 原始酶與突變酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 Characteristics of wild-type and mutant enzymes

在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)測(cè)定原始酶和突變酶的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性，通過(guò)圖6c可以看出，原始酶和突變酶的最適pH值為10.0，之后隨pH值的升高酶活力下降明顯。在pH 9.0出現(xiàn)酶活力先下降后上升的趨勢(shì)，分析其原因是更換了緩沖液的種類(lèi)；通過(guò)圖6d可以看出，原始酶和突變酶在pH 10.0～11.0的范圍內(nèi)酶活較為穩(wěn)定，保留了80%以上活力，之后隨pH值的升高酶活力下降明顯。說(shuō)明與原始酶相比，突變酶在pH值方面的酶學(xué)性質(zhì)無(wú)明顯變化，保持了原始酶的嗜堿性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將來(lái)源于Bacillussp. Y112的CGTase N末端起第81位氨基酸的精氨酸突變?yōu)樘K氨酸，突變體在保留了原始酶耐熱性、嗜堿性及熱穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，明顯降低了α-CD產(chǎn)量，提高了β-CD產(chǎn)量，分析原因可能是因?yàn)榫彼嵬蛔優(yōu)樘K氨酸后，氨基酸側(cè)鏈變短，減小了空間位阻，增加了底物結(jié)合活性位點(diǎn)的空間，有利于生成較大體積的CD產(chǎn)物。通過(guò)分析氫鍵作用力，發(fā)現(xiàn)氨基酸突變后與周?chē)被峒暗孜锏臍滏I作用力有明顯改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可使研究者進(jìn)一步了解底物結(jié)合亞基-3位氨基酸殘基與環(huán)化反應(yīng)的相關(guān)性。突變體R81T對(duì)提高催化產(chǎn)物的專(zhuān)一性以及應(yīng)用于工業(yè)化CD生產(chǎn)有重要意義。

然而單一突變?cè)诟纳飘a(chǎn)物特異性方面的作用有限，迭代飽和誘變[26]是CGTase定向進(jìn)化的有效方法。Han Ruizhi等[27]利用這項(xiàng)技術(shù)建立了多位點(diǎn)突變體Y167S/G179K/N193R/G180R，其L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷滴度達(dá)到2.12 g/L，比野生型高84%。Tao Xiumei等[28]構(gòu)建的突變體K228R/M230L達(dá)到了迄今為止報(bào)道的最高L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷濃度（211 g/L、624 mmol/L）。因此，可以利用迭代飽和誘變技術(shù)在突變體R81T基礎(chǔ)上構(gòu)建多位點(diǎn)突變體進(jìn)行研究，旨在得到產(chǎn)物特異性高并符合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)酶[29]。