徐 誼，徐 祥，王守峰，楊日榮，茅乃權，潘 泓

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸瘤外科，南寧 530021)

微小RNA(miRNA)是長度約為22個核苷酸的非編碼內(nèi)源性小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平與靶mRNA的3′UTR(untranslated region)結合，是腫瘤基礎研究領域的熱門話題[1]。miRNA-191與腫瘤的關系也日益受到學者的重視，其定位于人類染色體 3p21.31，在多種腫瘤中存在不同程度的高表達，miRNA-191作為一種潛在的疾病標志物和治療靶點正日益受到關注[2-3]。但是關于miRNA-191啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究還鮮有報道，本研究旨在探討非小細胞肺癌(NSCLC)miRNA-191啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其與臨床病理特征間的關系，為進一步證實miRNA-191在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中的意義奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月至2016年11月在本院手術切除的NSCLC腫瘤標本105份及對應距腫瘤組織邊緣大于或等于5 cm的癌旁組織105份，所獲標本均符合以下要求：(1)術后經(jīng)組織病理學確診為NSCLC；(2)術前未行放療、化療及免疫治療；(3)患者及家屬均理解并簽署知情同意書；(4)標本離體后即刻置于液氮中，迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃的冰箱中保存。病例的納入標準：(1)患者的姓名、年齡、性別、組織類型、TNM分期、組織分化程度、生存時間等個人資料及臨床病理資料完整；(2)患者術后病理標本均經(jīng)過病理學專家確診為NSCLC；(3)按照WHO國際組織學分類標準進行分期。本研究已通過廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的審查批準。

1.2 方法

1.2.1試驗主要試劑

實驗主要試劑DNA提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，EZ DNA Methylation-DirectTMKit購自美國ZYMO RESEARCH公司，Taq酶、PCR buffer等購自日本TAKARA公司。

1.2.2組織DNA提取

先用液氮研磨腫瘤及癌旁肺組織，然后依據(jù)Omega DNA提取試劑盒說明書中的順序提取DNA，再用瓊脂糖電泳檢測DNA純度，同時采用紫外分光光度計進行定量。

1.2.3DNA亞硫酸氫鹽修飾及回收

DNA的亞硫酸鹽修飾按照EZ DNA Methylation-DirectTMKit(ZYMO RESEARCH)的說明書，在PCR儀上進行，修飾條件：98 ℃ 8 min，64 ℃ 3.5 h，4 ℃儲存20 h。按照試劑盒的純化試劑說明書對修飾完成后的DNA進行純化，再放于-20 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4miRNA-191啟動子查找及甲基化特異性PCR(MSP)引物設計

運用UCSC數(shù)據(jù)庫預測人 miRNA-191啟動子序列，提取啟動子上游2 kb區(qū)域。MethPrimer在線分析網(wǎng)站用于分析和預測miRNA-191啟動子的甲基化CpG島，并設計引物，由廣西南寧澳利可生物科技有限公司合成特異性甲基化引物和非甲基化引物。

1.2.5MSP

(1)MSP巣式PCR第一步引物及循環(huán)條件。上游引物：5′-ATT TTT TTT AGG GTT TTA GAG ATG G-3′，下游引物：5′-CCA CCT CCC CTT CTA TTA TTC T-3′，目的條帶為221 bp。94 ℃預變性1 min，94 ℃變性5 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5個循環(huán)；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5個循環(huán)；94 ℃ 變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，20個循環(huán)。(2)巣式PCR第二步引物及循環(huán)條件。甲基化上游引物：5′-TAT TTG GGT TAG GGC GTT GTT TAG G-3′，甲基化下游引物：5′-CAA CTA TTA TCT CCA AAA CAT TCC A-3′，目的條帶為82 bp；非甲基化上游引物：5′-TAT TTG GGT TAG GGT GTT GTT TAG G-3′，非甲基化下游引物：5′-CAA CTA TTA TCT CCA AAA CAT TCC A-3′，目的條帶為82 bp。94 ℃預變性1 min，94 ℃變性5 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5個循環(huán)；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，5個循環(huán)；94 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，25個循環(huán)。

1.2.6PCR產(chǎn)物電泳

在電泳槽中放入2%瓊脂糖凝膠，并添加TAE緩沖液，直到液面比凝膠表面高1～2 mm。將PCR產(chǎn)物加入凝膠樣品孔，電壓設為100 V，電泳時間20 min，于紫外線燈下觀察具體的電脈情況。

1.2.7結果判定

用甲基化引物和非甲基化引物擴增肺癌組織和癌旁組織，如果基因發(fā)生甲基化，則用甲基化引物擴增出的DNA產(chǎn)物將產(chǎn)生相應的甲基化目標條帶；若基因未出現(xiàn)甲基化，則非甲基化引物擴增出相應的非甲基化目標條帶。根據(jù)miRNA-191啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)將患者分為甲基化組和非甲基化組，采用Kaplan-Meier分析患者的預后。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 肺癌患者的基線資料

105例患者中，男76例，女29例；其中鱗癌69例，腺癌36例；低、未分化者82例，高、中分化者23例；TNM分期中，Ⅰ+Ⅱ期89例，Ⅲ+Ⅳ期16例。

2.2 篩選出合適的引物

運用UCSC數(shù)據(jù)庫預測人 miRNA-191啟動子序列，提取啟動子上游2 kb區(qū)域。MethPrimer網(wǎng)站分析和預測人miRNA-191啟動子區(qū)的甲基化CpG島(圖1)，根據(jù)結果，共設計出7對甲基化特異性引物和非甲基化引物，同時篩選出合適的引物。

圖1 miRNA-191啟動子區(qū)CpG島的預測及各CpG位點(陰影部分為CpG島)

2.3 MSP檢測miRNA-191啟動子區(qū)的甲基化水平

對癌旁組織及肺癌組織的DNA進行亞硫酸鹽修飾后再行PCR擴展，結果顯示，在105份癌旁組織標本中共有87份發(fā)生甲基化，甲基化率為82.86%；在105份腫瘤組織中共有48份發(fā)生甲基化，甲基化率為45.71%。癌旁組織與肺癌組織的miRNA-191啟動子甲基化率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=37.87，P<0.01)。miRNA-191啟動子MSP電泳圖，見圖2。

T：肺癌組織；N：癌旁肺組織；M：甲基化引物；U：非甲基化引物。

2.4 NSCLC組織中miRNA-191啟動子甲基化水平及其與臨床病理特征間的相關性分析

對NSCLC患者甲基化組和非甲基化組的miRNA-191啟動子甲基化水平與患者的年齡、性別、腫瘤組織分化程度、組織類型、TNM分期等臨床病理特征間的相關性分析結果顯示，肺癌組織miRNA-191啟動子甲基化率與癌組織的細胞分化程度及TNM分期相關，非甲基化組比甲基化組的分化程度更低(χ2=6.75，P=0.01)，且非甲基化組NSCLC患者TNM分期更晚(χ2=4.27，P=0.04)。但miRNA-191啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡及肺癌組織學類型等無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

表1 miRNA-191啟動子甲基化狀態(tài)與臨床病理特性的關系[n(%)]

2.5 NSCLC患者miRNA-191啟動子甲基化狀態(tài)和患者預后的相關性分析

Kaplan-Meier分析結果顯示，miRNA-191啟動子區(qū)甲基化組患者的總生存期明顯高于非甲基化組患者(χ2=6.06，P=0.01)，見圖3。

圖3 NSCLC患者miRNA-191啟動子甲基化狀態(tài)與OS的Kaplan-Meier分析圖

3 討 論

NSCLC約占所有肺癌類型的80%，且發(fā)病率和病死率逐年上升。有研究表明，表觀遺傳和細胞內(nèi)遺傳的異常改變是造成人類惡性腫瘤細胞產(chǎn)生的主要因素[4]。表觀遺傳學的改變不僅發(fā)生在惡性腫瘤的早期階段，還在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而DNA甲基化的研究是表觀遺傳學的重要內(nèi)容[5-6]。近年來，對miRNA的甲基化研究逐漸深入后發(fā)現(xiàn)，許多miRNA啟動子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)是某些癌基因及抑癌基因的“調(diào)控開關”，啟動子區(qū)的高度甲基化會使基因的表達降低,而去甲基化則可以使被沉默的基因恢復表達[7-8]。 對miRNA-191的研究是當今細胞生物學領域的熱點，有研究指出，miRNA-191在腫瘤的增殖與遷移中起著重要的作用[9-11]。隨著研究的進一步深入，眾多學者開始探索miRNA-191在癌癥發(fā)生、發(fā)展中的機制，但其具體機制尚不清楚。XU等[12]研究報道，miRNA-191的過表達能促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和癌癥干細胞(CSC)增殖遷移，同時具有促進細胞間質(zhì)化并抑制細胞分化的能力，并且可以誘導癌癥的發(fā)生和促進癌癥細胞的早期轉(zhuǎn)移。LIU等[13]研究報道，miRNA-191還可以誘導H1299和A549兩個細胞系對放射產(chǎn)生抗拒作用。在肝癌的研究中也有報道，miRNA-191高表達可以預測肝癌患者的預后不良[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的甲基化改變會影響miRNA的表達，可能導致下游的增殖或者凋亡相關的癌蛋白異常表達，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。目前，尚鮮有關于miRNA-191啟動區(qū)甲基化狀態(tài)對miRNA-191表達影響的報道。因此，研究癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中miRNA-191基因啟動子甲基化狀態(tài)的改變及其影響，對探明腫瘤的發(fā)生機制，具有非常重要的意義。

目前，關于NSCLC中基因啟動子區(qū)的甲基化研究很多，但關于miRNA的相對較少，多在miRNA-137、miRNA-34b/c、miRNA-196a等的啟動子區(qū)甲基化水平的研究中，且證明與miRNA的表達及肺癌的惡性程度有關[17]。本研究結果顯示，NSCLC腫瘤組織的甲基化率明顯低于癌旁正常肺組織，并且相較甲基化組的患者，非甲基化組的腫瘤具有組織分化程度低、TNM分期晚、預后差的特點。提示非甲基化狀態(tài)可能參與腫瘤增殖轉(zhuǎn)移過程,并影響預后。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沉默肺癌A549細胞的miRNA-191后，通過劃痕實驗和Transwell實驗可發(fā)現(xiàn)肺癌A549細胞的遷移能力減弱，同時也證實了miRNA-191高表達與NSCLC患者的不良預后有關[18]。本課題組一直關注NSCLC中miRNA-191表達上調(diào)的原因，通過在生物信息學網(wǎng)站的分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-191啟動子區(qū)有豐富CPG島，甲基化的異常通常都發(fā)生在CPG島，與癌癥的發(fā)展密切相關。同時，通過TCGA數(shù)據(jù)庫可以發(fā)現(xiàn)，miRNA-191啟動子區(qū)有甲基化水平明顯降低的位點，表明miRNA-191啟動子區(qū)甲基化異常，與此次試驗結果相符合。提示miRNA-191啟動子區(qū)的低甲基化水平可能是導致miRNA-191高表達的關鍵因素，本課題組將在后續(xù)的研究中進一步驗證。

本研究結果表明，NSCLC患者的miRNA-191啟動子區(qū)存在異常甲基化，并且其甲基化狀態(tài)與患者臨床病理特征關系密切，有望成為判斷NSCLC預后的候選指標。