劉 菊 柳 媛 金振宇 薛建國(guó) 袁紅霞

（1.昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇昆山215300；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

反流性食管 炎（reflux esophagitis，RE）又稱糜爛性食管炎（erosive esophagitis，EE），是 指胃或十二指腸內(nèi)容物反流入食管，引起食管黏膜損傷的一種疾病，主要病理表現(xiàn)為食管黏膜的炎性損傷和愈復(fù)過(guò)程[1]。RE屬于胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD），流行病 學(xué)調(diào)查顯示，GERD的全球患病率約為13.98%，中國(guó)約為4.16%，而RE約 占GERD的30%～40%[2]。RE破 壞正常的食管鱗狀上皮，并發(fā)癥包括食管潰瘍、狹窄、Barrett食管等，其中Barrett食管被認(rèn)為是食管腺癌的前身。因此，早期截?cái)嗍彻苎装Y，對(duì)防治RE并發(fā)癥，預(yù)防食管腺癌很有必要。

有研究表明，RE并不是開(kāi)始于食管黏膜表面的化學(xué)性損傷，而是始于反流物誘發(fā)的細(xì)胞因子聚集介導(dǎo)的食管炎癥反應(yīng)[3]。白介素-18（interleukin-18，IL-18）是一種強(qiáng)力促炎因子，已有研究證實(shí)IL-18對(duì)Barrett食管及食管腺癌具有免疫調(diào)節(jié)作用[4-5]，但其在RE中的研究報(bào)道較少。本研究觀察了旋覆代赭湯對(duì)RE模型大鼠IL-18及相關(guān)炎癥因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase -2，COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)的影響，探索旋覆代赭湯對(duì)RE的治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠60只，12周齡，體質(zhì)量（220±20）g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，合格證號(hào)：1100111911047350，飼養(yǎng)于天津市南開(kāi)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)天津市南開(kāi)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，編號(hào)：NYKKDWL-2019-083。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 旋覆代赭湯使用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的顆粒劑，參考前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[6]，將《傷寒論》第161條原方劑量按漢代度量衡折算為：旋覆花15g、赭石5g、生姜25g、半夏15g、人參10g、炙甘草15g、大棗10g。依據(jù)“人和動(dòng)物體表面積折算等效劑量比率表”計(jì)算大鼠用藥劑量為人類劑量的6.25倍，顆粒劑加熱水充分?jǐn)嚢韬螅渲瞥蓾舛葹?.989g/mL的溶液。奧美拉唑腸溶片，由阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：J20130093；枸櫞酸莫沙必利片，由魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：H19990317。奧美拉唑+莫沙必利配制成濃度為0.26 mg/mL的混懸液（奧美拉唑0.208 mg/mL，莫沙必利0.052 mg/mL）。上述藥液均密封后放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：各梯度酒精、二甲苯、蘇木精/伊紅染色劑等病理染色基本試劑由天津市南開(kāi)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所提供；IL-18、IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法試劑盒（批號(hào)：BG190308RAC、BG190218RAC、BG190218RAC），上海藍(lán)基生物科技有限公司生產(chǎn)；IL-18、COX-2、iNOS抗體（批號(hào)：ab191860、ab52237、ab15323），英國(guó)Abcam公司生產(chǎn)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PAB180002、PAB180013、PAB180024），Bioswamp公司生產(chǎn)。

主要儀器：超薄切片機(jī)（型號(hào)：EMUC6），正置熒光顯微鏡（型號(hào)：DM400B+DFC500+LA），德國(guó)Leica公司；倒置相差光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：IX71），日本Olympus；電子顯微鏡（型號(hào)：H7650），日本日立公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：Universal Hood Ⅱ），化學(xué)發(fā)光分析儀（型號(hào)：ChemiDocXRS），電泳儀（型號(hào)：MiNi Proteam 3 Cell），美國(guó)Bio-Rad公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)：H2050R），湖南湘儀集團(tuán)；恒溫水浴箱（型號(hào)：DZKW-4），北京中興偉業(yè)儀器有限公司；分光光度計(jì)（型號(hào)：KHB-ST-360），上海科華生物。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 60只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組（奧美拉唑+莫沙必利）、中藥組（旋覆代赭湯），每組15只。除正常組外，其余各組大鼠采用“4.2 cm幽門夾+2/3胃底結(jié)扎術(shù)”[7]制備RE模型。術(shù)后24 h禁食不禁水，此后常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后3 d內(nèi)，每天每只大鼠給予1.5 mg/kg鹽酸左氧氟沙星注射液腹腔注射。

2.2 藥物干預(yù) 術(shù)后第8天開(kāi)始，每日模型組給予生理鹽水1 mL/100g體質(zhì)量灌胃，正常組同期予等量生理鹽水灌胃，西藥組與中藥組給予相應(yīng)藥液1 mL/100g體質(zhì)量灌胃，每日分2次，連續(xù)14 d。

2.3 取材 各組大鼠最后一次灌胃結(jié)束后，禁食不禁水24 h，0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射過(guò)量麻醉劑處死，常規(guī)開(kāi)腹采集腹主動(dòng)脈血，置于離心管中室溫靜置1 h以上，常溫825×g離心10 min，取上清，置于EP管中，-80 ℃保存待檢測(cè)，用于血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定。開(kāi)腹后縱向剖開(kāi)食管，觀察食管黏膜表象并進(jìn)行病理分級(jí)，取胃食管交界上0.5 cm處向咽喉部截取1.5～2.0 cm食管組織，分為2份，一份制備病理切片，一份-80 ℃凍存待測(cè)。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 食管黏膜肉眼表現(xiàn)、RE分級(jí)及病理形態(tài)學(xué)觀察 將各組大鼠食管腔用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，縱行切開(kāi)，肉眼觀察食管黏膜大體表現(xiàn)并進(jìn)行RE分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化內(nèi)鏡分會(huì)發(fā)布的《反流性食管炎診斷及治療指南（2003年）》[8]。取食管下段小塊組織，置于組織包埋盒中，使用10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋制備病理切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，通過(guò)光鏡觀察病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

2.4.2 Western blot檢測(cè)食管組織中IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達(dá) 用清潔的手術(shù)剪將食管組織塊盡可能剪碎，置于EP管內(nèi)稱重。按每20 mg組織200 μL裂解液的比例加入勻漿器中勻漿，置于冰上30 min，每隔10 min搖晃一次助溶，于4 ℃、1200×g離心15 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量法測(cè)定樣本蛋白濃度，制備SDS-PAGE濃縮膠及分離膠，轉(zhuǎn)膜后加入一抗、二抗孵育，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

2.4.3 ELISA法檢測(cè)血清中IL-18、IL-6、TNF-α含量 將分離的血清采用雙抗體夾心法進(jìn)行操作。按次序加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入100 μL樣品，空白對(duì)照加入100 μL PBS，各孔加入50 μL酶標(biāo)溶液，密封后37 ℃孵育1 h。充分洗滌酶標(biāo)板，吸水紙拍干后加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃下避光反應(yīng)15～20 min后加入50 μL終止液。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣本的OD值代入方程式，計(jì)算樣本實(shí)際濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，Graphpad 6.0繪制統(tǒng)計(jì)圖。等級(jí)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，兩兩比較采用混合排秩后行方差分析。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；若方差不齊或不符合正態(tài)分布，采用welch檢驗(yàn)。組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠死亡情況 各組大鼠于處死前，共死亡8只。正常組大鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)死亡；模型組1只死于幽門梗阻，1只死于腹腔感染，1只死于腸梗阻；中藥組1只死于幽門梗阻，1只死于肺感染；西藥組2只死于腹腔感染，1只死于腸梗阻。最終剩余：正常組15只，模型組12只，中藥組13只，西藥組12只。

3.2 各組大鼠食管黏膜肉眼表現(xiàn)及RE分級(jí) 正常組大鼠食管黏膜光滑，無(wú)肉眼可見(jiàn)病理改變。模型組大鼠食管黏膜充血明顯，中下端可見(jiàn)點(diǎn)片狀紅斑改變，散見(jiàn)針尖至米粒樣大小不等白色潰瘍，少數(shù)食管下端出現(xiàn)“樹(shù)皮樣”增生白斑。中藥組大鼠食管黏膜平整，多數(shù)食管下端有水腫，色澤粉紅，散見(jiàn)充血點(diǎn)，未見(jiàn)糜爛性潰瘍及增生白斑。西藥組大鼠食管黏膜較光滑平整，未見(jiàn)糜爛、潰瘍或增生白斑。各組大鼠食管黏膜肉眼RE分級(jí)見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠食管黏膜肉眼RE分級(jí) 單位：只

3.3 各組大鼠食管黏膜組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠光鏡下可見(jiàn)食管黏膜層表面為非角化復(fù)層鱗狀上皮，基底細(xì)胞層中有少許黑色素母細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞。模型組可見(jiàn)食管鱗狀上皮基底細(xì)胞增生，固有膜乳頭延長(zhǎng)，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)黏膜糜爛或潰瘍形成，少數(shù)有柱狀上皮化生。中藥組大鼠食管黏膜鱗狀上皮增生較少，糜爛、潰瘍等病理較少出現(xiàn)，黏膜間質(zhì)見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。西藥組大鼠食管黏膜鱗狀上皮內(nèi)可見(jiàn)慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間隙增寬，未見(jiàn)明顯糜爛、潰瘍。見(jiàn)圖1。

3.4 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠食管組織中IL-18、COX-2、iNOS 蛋白含量明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組、西藥組上述指標(biāo)蛋白表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01）；中藥組與西藥組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表2。

圖1 各組大鼠食管黏膜組織病理表現(xiàn)（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠食管組織IL-18、COX-2、iNOS蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 IL-18/GAPDH COX-2/GAPDH iNOS/GAPDH正常組 15 0.55±0.15 0.39±0.08 0.18±0.10模型組 12 1.42±0.36** 0.77±0.07** 0.71±0.09**中藥組 13 0.94±0.32△△ 0.53±0.08△△ 0.24±0.04△△西藥組 12 0.97±0.42△△ 0.48±0.05△△ 0.31±0.04△△

3.5 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達(dá)比較 模型組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組、西藥組上述指標(biāo)表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05）。中藥組與西藥組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s） 單位：pg/mL

表3 各組大鼠血清IL-18、IL-6、TNF-α表達(dá)比較（±s） 單位：pg/mL

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)/只 IL-18 IL-6 TNF-α正常組 15 170.65±14.62 18.08±7.01 168.65±9.29模型組 12 1 088.79±36.41** 81.06±9.51** 186.52±5.87**中藥組 13 933.76±39.65△ 35.97±5.59△ 177.00±6.16△西藥組 12 917.48±45.67△ 23.77±4.30△ 176.29±4.70△

4 討論

4.1 正氣不足、邪氣有余的炎癥微環(huán)境是RE的內(nèi)在發(fā)病基礎(chǔ) 正氣是存在于人體內(nèi)的一類具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能、適應(yīng)環(huán)境刺激、抵御外邪侵襲等作用的細(xì)微物質(zhì)，正氣作為人體固有的生理之氣，與邪氣存在對(duì)立制約關(guān)系。“正氣存內(nèi)，邪不可干”，將邪正盛衰的斗爭(zhēng)作為人體虛實(shí)變化及疾病產(chǎn)生的內(nèi)在根源。體內(nèi)正氣充足則衛(wèi)外得固、氣機(jī)調(diào)暢，機(jī)體可維持正常生理功能，保持免疫環(huán)境穩(wěn)定，抵御外在致病因素的侵襲；“邪之所湊，其氣必虛”，若正氣不足，則衛(wèi)外不固，氣機(jī)升降出入失于暢達(dá)，免疫內(nèi)環(huán)境失穩(wěn)，外邪侵襲，外界的病原微生物或機(jī)體自帶的炎癥因子乘虛而起，形成炎癥性疾病。正氣不足、邪氣有余是慢性炎癥性疾病的內(nèi)在發(fā)病基礎(chǔ)，治療此類慢性炎癥性疾病應(yīng)著眼于扶正補(bǔ)虛、調(diào)節(jié)免疫[9-10]。RE是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)在食管疾病中的作用已被證實(shí)，因此正氣不足導(dǎo)致的炎癥微環(huán)境也應(yīng)成為RE治療的著眼點(diǎn)之一。

4.2 IL-18是炎癥免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子 IL-18是一種強(qiáng)有力的促炎因子，在炎癥及免疫應(yīng)答中具有重要作用。IL-18基因位于人類的11號(hào)染色體上，編碼193個(gè)氨基酸的前體，最初作為無(wú)活性的24 kDa前體合成，在巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、人外周血單核細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等細(xì)胞中累積[11-12]。IL-18前體在細(xì)胞內(nèi)被蛋白水解酶caspase 1加工成18 kDa的成熟IL-18蛋白。Caspase 1可通過(guò)與各種典型的炎性小體包括NLRP3、NLRP4、NLRP1等結(jié)合而被激活，從而促進(jìn)IL-18加工成熟并釋放。成熟的IL-18通過(guò)與其受體，即IL-18R結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，其受體由異源二聚體組成，廣泛存在于多種細(xì)胞中，屬于IL-1R/Toll樣（TLR）受體超家族。IL-18的初級(jí)受體為IL-18Rα，共受體為IL-18Rβ，三者結(jié)合形成IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ三元復(fù)合物，觸發(fā)炎癥反應(yīng)信號(hào)。IL-18/IL-18Rα/IL-18Rβ復(fù)合物已被證明可誘導(dǎo)多種炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等的合成和分泌[13]，與COX-2存在劑量依賴性[14]，同時(shí)參與NFκB、NLRP3、STAT3和MAPK等多條信號(hào)通路，構(gòu)成復(fù)雜細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，形成自激活的循環(huán)連接，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥瀑布反應(yīng)，參與多種慢性炎癥性疾病[15-16]。

4.3 旋覆代赭湯可通過(guò)益氣和胃、免疫調(diào)節(jié)治療RE 正氣不足、邪氣有余導(dǎo)致的慢性炎癥是“正常食管-食管炎-Barrett食管-食管腺癌”進(jìn)展過(guò)程中的主要驅(qū)動(dòng)因素，了解食管炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的主要影響通路及關(guān)鍵促炎因子可以為反流性食管炎的治療提供重要參考。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，IL-18在RE模型大鼠食管組織及血清中呈現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)促炎因子COX-2、iNOS、IL-6、TNF-α在食管及血清中也呈現(xiàn)高表達(dá)，提示反流性食管炎中存在多種炎癥因子的活化聚集。經(jīng)方旋覆代赭湯可有效降低RE模型大鼠IL-18及相關(guān)促炎因子的含量，改善食管黏膜病理，提示旋覆代赭湯可以通過(guò)抑制促炎因子的表達(dá)，對(duì)反流性食管炎起到一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

我們前期通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃食管反流病患者呈現(xiàn)明顯的脾胃虛弱癥狀，且脾胃虛弱評(píng)分與胃食管反流癥狀評(píng)分呈正相關(guān)[17]，與患者自主神經(jīng)功能減弱呈正相關(guān)[18]，提示脾胃虛弱是胃食管反流的重要發(fā)病因素，這一結(jié)果與反流性食管炎“胃虛氣逆”的關(guān)鍵病機(jī)相吻合。脾胃為后天之本，氣血生化之源，是正氣的重要補(bǔ)充來(lái)源，“脾胃虛弱，正氣不足”可能是機(jī)體免疫漂移、食管炎癥微環(huán)境形成的內(nèi)在基礎(chǔ)。我們選用益氣補(bǔ)虛、和胃降逆之經(jīng)方旋覆代赭湯治療本病臨床療效顯著。本研究驗(yàn)證了旋覆代赭湯對(duì)IL-18及相關(guān)炎癥因子的抑制作用，結(jié)合前期研究，此抑炎作用的部分機(jī)制可能與其調(diào)控NF-κB、NLRP3信號(hào)通路有關(guān)[19-20]，在此過(guò)程中，IL-18是否作為關(guān)鍵炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)了免疫細(xì)胞遷移和局部聚集，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。