祖祥凱，黃蓓蓓

(1.川北幼兒師范高等?？茖W(xué)校，四川 廣元 628017；2.河南科技大學(xué) 應(yīng)用工程學(xué)院，河南 三門峽 472000)

1 概述

我國作為較大的蘋果生產(chǎn)國和消費(fèi)國，蘋果的種植面積和產(chǎn)量均占全球的45%以上，在世界蘋果產(chǎn)業(yè)中占有重要的地位。目前我國的蘋果主要以鮮果銷售為主，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2020年，我國的蘋果栽培面積在4000萬畝左右[1]，總產(chǎn)量為4500萬噸[2]，對于優(yōu)質(zhì)的蘋果，通過鮮銷的手段基本可以保證產(chǎn)銷的平衡，但是還剩余20%左右的蘋果屬于普通果和次等果，必須通過加工的手段和方法來解決，蘋果醋或者蘋果汁是目前我國蘋果加工的主導(dǎo)產(chǎn)品[3]。

蘋果醋是由蘋果經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵后制成，富含維生素、氨基酸、纖維素、果膠和有機(jī)酸等營養(yǎng)成分，具有蘋果和食醋共有的營養(yǎng)保健功能[4]，相關(guān)的產(chǎn)品主要有蘋果醋片、蘋果醋飲料和調(diào)味蘋果醋?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蘋果醋中的有機(jī)酸能夠維持機(jī)體內(nèi)的酸堿平衡，具有消除人體疲勞的功效；蘋果中的尼克酸具有調(diào)節(jié)人體血糖和血壓的作用[5-6]；蘋果醋中的氨基酸和黃酮類物質(zhì)能夠有效地清除人體內(nèi)的過氧化基，起到延緩機(jī)體衰老和提高機(jī)體免疫力的功效[7]。

蘋果醋在歐洲發(fā)達(dá)國家起步早、工藝先進(jìn)、種類多樣，特別是日本加工的蘋果醋是保健果醋的代表。我國的果醋加工起步較晚，主要研發(fā)目的是解決水果資源過剩和進(jìn)一步提高水果本身的附加值[8]。最先以一些簡單的水果：葡萄、蘋果和梨等進(jìn)行果醋的加工[9]，隨著人們對果醋保健效果的認(rèn)知越來越深，一些新型的加工方法和果醋種類才誕生。蘋果醋中含有豐富的營養(yǎng)成分，能被開發(fā)為蘋果醋飲料或調(diào)味品。本研究通過對蘋果醋發(fā)酵工藝的優(yōu)化，以期獲得蘋果醋發(fā)酵的最佳工藝條件[10-11]。

2 材料與方法

2.1 材料

蘋果、分光光度計(jì)、水浴鍋、分析天平、榨汁機(jī)、培養(yǎng)箱、酸度計(jì)、高效色譜儀、超凈工作臺、手提式不銹鋼蒸汽消毒器、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硝酸鋁、酒石氨酸、硫酸鐵、硫酸銅和硫酸鎂。

菌種(購于中國北京微生物研究所)：菌株1、菌株2和菌株3均為釀酒酵母。

2.2 蘋果醋加工工藝流程

新鮮蘋果→清洗、去皮→磨碎→酶處理→調(diào)節(jié)甜度→酒精發(fā)酵→醋酸發(fā)酵→包裝→殺菌→蘋果醋成品。

2.3 酵母菌發(fā)酵能力的測試

二氧化碳失重法：酒精發(fā)酵的過程中產(chǎn)生二氧化碳，通過測定酒精發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的二氧化碳重量多少為酵母菌發(fā)酵能力的強(qiáng)弱[12-13]。

2.4 蘋果醋中菌落總數(shù)的測定

根據(jù)國際通用的對健康食品中微生物含量的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)微生物含量小于108個(gè)/mL時(shí)符合安全指標(biāo)，當(dāng)微生物濃度超過該指標(biāo)后，則表示為變質(zhì)食物。對蘋果醋中的微生物采用統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行計(jì)算和處理，結(jié)果以對數(shù)的形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[14]。

測定菌落時(shí)，在超凈工作臺上操作，將蘋果醋添加生理鹽水進(jìn)行稀釋，隨機(jī)取20 g稀釋100，1000，10000倍，每個(gè)稀釋度制作8個(gè)重復(fù)，最后統(tǒng)計(jì)的數(shù)值為20 g蘋果醋中微生物總數(shù)對數(shù)的平均值。

2.5 其他相關(guān)指標(biāo)的測定

還原糖含量的測定：斐林試劑法；酒精度的測定：蒸餾瓶法；總脂的測定：皂化法。

3 結(jié)果與分析

3.1 蘋果醋發(fā)酵菌種篩選

通過對圖1中不同菌株及菌株組合在蘋果醋發(fā)酵中二氧化碳失重量的測定結(jié)果可知，3個(gè)不同的酵母菌發(fā)酵菌株及菌株組合在發(fā)酵過程中，不同菌株發(fā)酵能力各不相同。在48 h內(nèi)，酵母菌的發(fā)酵能力明顯由最低上升到最高，然后又下降，到第6天降為最低，之后保持平穩(wěn)。其中菌株1+菌株2的組合為最佳組合，發(fā)酵能力明顯高于其他菌株組合，發(fā)酵峰值CO2的失重能力最高時(shí)結(jié)果為3.50 g，發(fā)酵周期較短，穩(wěn)定期為3 d。

圖1 不同菌株發(fā)酵速率的比較

通過對3個(gè)單菌株和3個(gè)菌株的組合進(jìn)行蘋果醋發(fā)酵試驗(yàn)對比，以酒精度、總脂含量和還原糖含量進(jìn)行對比。由圖2可知，酒精度與還原糖含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，酒精度高的還原糖濃度低。發(fā)酵結(jié)束后，還原糖的含量均呈現(xiàn)較低的水平?；旌暇?+菌株3和混合菌株1+菌株2的酒精產(chǎn)量分別為7.0%和7.5%，還原糖的含量為3.0%和2.8%。最佳發(fā)酵的混合菌株1+菌株2與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，選擇混合菌株1+菌株2作為最佳發(fā)酵菌株。

圖2 不同菌株和菌株組合的發(fā)酵特征

3.2 蘋果醋酒精發(fā)酵工藝優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)的參考文獻(xiàn)和單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了Plackett-Burman的矩陣，3個(gè)平行試驗(yàn)，將酒精含量的平均值作為響應(yīng)值Y，詳細(xì)結(jié)果見表1，分析結(jié)果見表2。

表1 數(shù)值為12的Placckett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表2 方差分析

由表2中可知，概率值小于0.05的有X1、X3、X5、X6和X8，這5個(gè)因素對酒精發(fā)酵的影響最為重要，按照影響力的大小進(jìn)行比較，X3>X5>X6，這3個(gè)影響因素分別為發(fā)酵溫度、接種量和菌種年齡對酒精發(fā)酵的影響。

由上述試驗(yàn)結(jié)果研究可知，確定了酒精發(fā)酵的3個(gè)影響因素，根據(jù)相關(guān)的參考文獻(xiàn)，結(jié)合Design-Expert 7.1對3個(gè)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和建立回歸模型，并對模型進(jìn)行方差分析，見表3。

表3 酒精含量二次模型方差分析表

使用Design-Expert 7.1軟件建立了發(fā)酵溫度、接種量和菌種年齡與酒精產(chǎn)量之間的響應(yīng)面，從而對將影響因素水平進(jìn)行優(yōu)化，通過分析獲得了最佳的酒精發(fā)酵條件，即最佳的菌種年齡為12 h的菌株1+菌株2，菌種的接種數(shù)量為7.0%，發(fā)酵溫度為25 ℃，試驗(yàn)結(jié)果與之前的研究結(jié)果相似[15-18]。

3.3 蘋果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

醋酸發(fā)酵也是蘋果醋發(fā)酵過程中至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，該步驟流程中醋酸菌能夠氧化乙醇，從而生成醋酸，生成醋酸的能力主要受醋酸菌株的菌種特性和發(fā)酵條件影響，醋酸菌的影響因素為發(fā)酵時(shí)間、溫度、接種量和液體總量，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4個(gè)影響因素的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)為優(yōu)化菌株1+菌株2的醋酸發(fā)酵工藝，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

由表4的極差分析結(jié)果可知，在醋酸發(fā)酵過程中，影響發(fā)酵結(jié)果的程度由大到小分別是發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量和發(fā)酵液體量。最優(yōu)水平組合是A2B3C2D2，使用菌株1+菌株2的醋酸發(fā)酵最優(yōu)工藝為：發(fā)酵溫度32 ℃、接種量10%、發(fā)酵時(shí)間144 min、液體量500 mL。

3.4 4種不同包裝材料對蘋果醋保質(zhì)期的影響

研究4種材料紙材料、玻璃材料、金屬材料和塑料在包裝蘋果醋時(shí)的保質(zhì)期長短，在包裝結(jié)束后，采用高溫進(jìn)行殺菌，設(shè)置殺菌溫度為110 ℃，殺菌時(shí)間為10 min。將殺菌完成后的蘋果醋放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每間隔15 d對蘋果醋中所含的微生物量進(jìn)行微生物總量檢測。

不同的包裝材料對蘋果醋保質(zhì)期的影響較小，通過比較4種包裝材料對蘋果醋保質(zhì)期的影響，由圖3可知，玻璃材料相對于其他3種材料具有較好的效果，微生物的含量明顯低于紙材料、金屬材料和塑料。紙材料包裝的蘋果醋在37 ℃放置75 d時(shí)，微生物的含量超過了108個(gè)/mL(國家食品安全指標(biāo))，此時(shí)已經(jīng)變質(zhì)。玻璃材料能在37 ℃的恒溫箱中有90 d的保質(zhì)期，微生物的總量超過108個(gè)/mL。

圖3 不同材料蘋果醋中保質(zhì)期內(nèi)微生物含量的比較

4 結(jié)論

通過對蘋果醋發(fā)酵工藝技術(shù)的優(yōu)化，得到最優(yōu)的酵母菌菌株為菌株1+菌株2；酒精發(fā)酵最佳的菌種年齡為12 h的菌株1+菌株2，菌種的接種數(shù)量為7.0%，發(fā)酵溫度為25 ℃；醋酸發(fā)酵的最佳條件為：發(fā)酵溫度32 ℃、接種量10%、發(fā)酵時(shí)間144 min、液體量500 mL。