侯麗霞，龐麗娜，龔 帥，何 煒

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州450052)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)作為僅次于肝細(xì)胞癌的第二大常見肝臟惡性腫瘤，包括多種膽管上皮性腫瘤，其中，肝內(nèi)膽管癌占10%～20%，肝門部膽管癌占50%，遠(yuǎn)端膽管癌占30%～40%[1]。CCA占所有原發(fā)性肝癌病例的10%～15%，占所有惡性腫瘤的比例不到1%，但在過去的40 a里，全球CCA的發(fā)病率逐年增加[2-3]。

膽管癌患者的預(yù)后差，5 a總生存率不到5%，主要是由于該腫瘤發(fā)病隱匿、診斷晚并且缺乏有效的非手術(shù)治療手段[4]。因此，對于膽管癌的治療迫切需要更多更有效的治療藥物，特別是分子靶向治療藥物。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF),又稱血管通透因子，是上皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種信號蛋白[5]。其是多種腫瘤新生血管形成和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因素，如胃癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌(包括CCA)[6]。臨床資料顯示VEGF在CCA中顯著升高[7-8]，阻斷VEGF/血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)通路可有效抑制多種腫瘤的增殖、遷移、侵襲和黏附能力，如肝細(xì)胞癌、胃癌和肺癌[9-10]。最近的研究證實自分泌VEGF在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制其凋亡中有重要作用[11-13]。

阿帕替尼(YN968D1)是最新的口服型VEGFR2酪氨酸激酶高選擇性抑制劑之一，在治療多種實體瘤方面有著令人鼓舞的臨床前和臨床資料[14-15]。VEGFR-2是VEGF介導(dǎo)的一種重要的抗凋亡因子，通過VEGFR-2/PI3K/Akt/mTOR途徑抑制凋亡。經(jīng)Ⅲ期臨床試驗證實，阿帕替尼是治療無化療指征的晚期胃癌的唯一有效藥物[16]。因此，阿帕替尼于2014年被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)并認(rèn)定為晚期或轉(zhuǎn)移性難治性胃癌的后續(xù)治療藥物[17]。在我國的Ⅱ～Ⅲ期臨床試驗中，阿帕替尼對多種腫瘤均顯示出良好的治療效果，如肝細(xì)胞癌[18]、非小細(xì)胞肺癌[19]、乳腺癌[20-22]和結(jié)直腸癌[23]。然而，阿帕替尼是否對人類CCA具有抗腫瘤作用尚不清楚。在本研究中，我們觀察了阿帕替尼對體內(nèi)外CCA細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑阿帕替尼(YN968D1)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；抗Bcl-2(目錄號sc-7382)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；抗cleaved caspases-3(目錄號9661)抗體購自美國Cell Signaling Biotechnology公司；抗Ki-67(目錄號MA5-14520)抗體購自美國Thermo Scientific公司。

人CCA細(xì)胞系HCCC9810和HuCCT1購自美國ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含高糖的DMEM培養(yǎng)基中，并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下添加胎牛血清(美國Gibco公司)、100 u/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)按照ATCC要求的培養(yǎng)條件。

1.2 細(xì)胞增殖實驗細(xì)胞(每孔1×103個)接種于96孔板中，隔夜培養(yǎng)后，用不同濃度的阿帕替尼(0、2.5、5、10和20 μmol/L)處理細(xì)胞，并培養(yǎng)24、48和72 h，然后添加20 μL Cell Titer 96 Aqueous One Solution試劑(美國Promega公司)，將細(xì)胞再培養(yǎng)1 h，最后在492 nm處讀取光密度(optical density,OD)值。

1.3 錨定非依賴性細(xì)胞生長實驗下層為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%瓊脂和含不同濃度阿帕替尼的完全培養(yǎng)基，上層為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%瓊脂和含相同濃度阿帕替尼的完全培養(yǎng)基，細(xì)胞(每孔8×103個)懸浮于上層的完全生長培養(yǎng)基中，然后在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，最后使用Image-Pro Plus v.6.0程序(美國Media Cybernetics公司)在倒置顯微鏡下對集落進(jìn)行計數(shù)。

1.4 Annexin V/PI染色法用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行Annexin V/PI染色。將細(xì)胞(每孔3×105個細(xì)胞)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h，并用不同濃度(0、2.5、5、10和20 μmol/L)的阿帕替尼處理24 h，然后洗滌細(xì)胞兩次，用磷酸鹽緩沖液再懸浮并在室溫下用Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶孵育10 min。用BD Acuri C6進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.5 裸鼠中抗腫瘤作用的測定BALB/c裸鼠，雌性，6～8周齡，購自自鄭州大學(xué)實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)在無菌動物室中，提供標(biāo)準(zhǔn)鼠料及蒸餾水，讓其自由采食及飲水。把懸浮于磷酸鹽緩沖液的HuCCT1細(xì)胞與基質(zhì)膠(美國BD Biosciences公司)11混合，抽取0.25 mL混合物(HuCCT1細(xì)胞量約3×106)接種于小鼠右側(cè)皮下，每3天測量一次腫瘤體積和體質(zhì)量，腫瘤體積公式：腫瘤體積(mm3)=1/2×長×寬2。當(dāng)腫瘤體積大小達(dá)到50～100 mm3時，將小鼠隨機(jī)分為3組(n=6～8，對照組，阿帕替尼50 mg/(kg·d)組，阿帕替尼100 mg/(kg·d)組)。小鼠被處死后移除腫瘤，將腫瘤組織用福爾馬林固定，石蠟包埋并切片，進(jìn)行免疫組化分析。

1.6 免疫組織化學(xué)法從每個石蠟塊中獲取一系列4 nm的切片，組織切片經(jīng)二甲苯脫石蠟后，用10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH=6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)，接著用體積分?jǐn)?shù)0.03%過氧化氫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后將切片在正常血清中封閉30 min，并在4 ℃下與一抗一起孵育過夜，最后在室溫下用二抗孵育60 min。所有切片均使用Vectastain ABC 試劑盒(美國Vector實驗室)和蘇木精在顯微鏡下(200×)進(jìn)行復(fù)染。使用Image Pro Plusv.6.0程序(美國Media Cybernetics公司)進(jìn)行IHC染色定量分析。

2 結(jié)果

2.1 阿帕替尼抑制CCA細(xì)胞增殖和集落形成對CCA細(xì)胞的細(xì)胞增殖和集落形成能力的評估顯示，阿帕替尼以時間和劑量依賴的方式抑制HCCC9810和HuCCT1細(xì)胞系的增殖，其中，對HuCCT1細(xì)胞系的增殖抑制作用更為明顯(圖1)。在2株細(xì)胞系中，阿帕替尼處理24 h的抑制作用弱于處理48 h和72 h。經(jīng)阿帕替尼處理72 h，不同濃度(2.5、5、10和20 μmol/L)阿帕替尼組與對照組之間的療效比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

軟瓊脂中的細(xì)胞集落形成也被阿帕替尼以劑量依賴的方式抑制，在HuCCT1細(xì)胞中最為顯著(圖1)，這表明阿帕替尼可以抑制CCA細(xì)胞增殖，值得進(jìn)一步研究。

圖1 阿帕替尼(μmol/L)抑制CCA細(xì)胞增殖及集落形成

2.2 阿帕替尼促進(jìn)CCA細(xì)胞凋亡采用Annexin V/PI雙染色法和流式細(xì)胞術(shù)探討阿帕替尼對CCA細(xì)胞的抗增殖作用是否與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。用2.5、5、10和20 μmol/L的阿帕替尼處理CCA細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)阿帕替尼處理后早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞均有所增加，而且經(jīng)阿帕替尼處理后細(xì)胞凋亡率也顯著增加(P<0.05)(圖2)。

圖2 阿帕替尼促進(jìn)CCA細(xì)胞系凋亡

2.3 裸鼠移植瘤模型中阿帕替尼抗CCA作用的研究阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組與對照組治療期間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，然而，阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組與對照組的體質(zhì)量減輕比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組和阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組的腫瘤體積明顯減小，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)(圖3)。

為了解釋上述現(xiàn)象，我們采用免疫組織化法檢測Ki-67、Bcl-2和cleaved-caspase 3的表達(dá)水平，進(jìn)而對阿帕替尼的分子作用機(jī)制進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，阿帕替尼治療組ki-67和Bcl-2的表達(dá)明顯降低，而cleaved-caspase 3的表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖3)。這表明阿帕替尼可以通過調(diào)節(jié)Ki-67、Bcl-2和cleaved-caspase 3的表達(dá)水平發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖3 阿帕替尼能抑制裸鼠中HuCC1腫瘤情況

3 討論

本研究旨在探討阿帕替尼對體內(nèi)外CCA細(xì)胞的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制，因此我們進(jìn)行了細(xì)胞增殖實驗、凋亡實驗，并建立了裸鼠移植瘤模型。細(xì)胞增殖實驗顯示，阿帕替尼以時間和劑量依賴的方式直接抑制HCCC9810和HuCCT1細(xì)胞系的細(xì)胞增殖和集落形成。在既往的研究中，阿帕替尼能抑制肝癌、膽管癌和其他類型腫瘤的腫瘤細(xì)胞增殖[24-25]。Annexin V/PI染色顯示，阿帕替尼誘導(dǎo)CCA細(xì)胞凋亡，這與細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果一致。

裸鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，在整個過程中，阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組的小鼠體質(zhì)量并未明顯減輕，但仍需對其長期應(yīng)用進(jìn)一步研究，阿帕替尼100 mg/(kg·d)治療組的小鼠體質(zhì)量明顯減輕(P<0.05)。在臨床中，我們也發(fā)現(xiàn)一部分患者在經(jīng)阿帕替尼治療后體質(zhì)量減輕。然而阿帕替尼50 mg/(kg·d)治療組與100 mg/(kg·d)治療組的小鼠腫瘤體積均有明顯減小(P<0.05)。另外，阿帕替尼能降低Ki-67和Bcl-2表達(dá)同時增加cleaved-caspase 3的表達(dá)。這些均表明阿帕替尼能抑制體內(nèi)CCA細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與體外實驗的結(jié)果一致。

膽管癌起源于膽管上皮細(xì)胞，其中90%以上為腺癌。到目前為止，根治性手術(shù)切除是其可能治愈的唯一治療方法。然而，只有20%到40%的患者可以進(jìn)行手術(shù)切除，因為大多數(shù)患者在診斷時腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移或者局部晚期，放化療是近幾十年來的主要治療手段。局部晚期或轉(zhuǎn)移性膽管癌的標(biāo)準(zhǔn)一線治療是吉西他濱加氟尿嘧啶或鉑，替吉奧已被研究作為吉西他濱難治的晚期膽管癌患者的二線治療[26]。在一項標(biāo)準(zhǔn)的、實用的臨床調(diào)查(ABC-2研究)中，410例晚期膽管癌患者被隨機(jī)分配接受吉西他濱聯(lián)合順鉑或單獨使用吉西他濱，聯(lián)合治療組患者的中位總生存期為11.7個月，單用吉西他濱組患者的中位總生存期為8.1個月，然而，與其他臨床試驗相比，聯(lián)合治療獲益很小，而且研究的患者數(shù)量也很少[27]。

因此，迫切需要新的藥物或化療方案作為膽管癌患者的治療選擇。我們先前報道了一例肝內(nèi)膽管癌患者，在經(jīng)吉西他濱和順鉑聯(lián)合化療進(jìn)展后，接受了阿帕替尼靶向治療，達(dá)到了6個月的無進(jìn)展生存期[28]。此次實驗研究結(jié)果表明，阿帕替尼通過影響CCA腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，對CCA有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，阿帕替尼可能是治療CCA的新選擇。