關(guān)夢琦 崔巖,2 李珊山,2

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院皮膚科，長春 130021；2.吉林省皮膚性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130021)

吞噬(phagocytosis)是機(jī)體防御真菌感染的重要措施，專業(yè)吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和非專業(yè)吞噬細(xì)胞如角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞，可通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，如toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、C型凝集素受體(C-type Lectins ,CLRs)如Dectin-1或甘露糖受體(Mannose receptor)，識別并結(jié)合微生物表面的病原相關(guān)分子模式 (pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，激活胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)、骨架重排，將病原體內(nèi)吞形成吞噬泡并與溶酶體融合進(jìn)行消化微生物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬過程中重要的標(biāo)志蛋白LC3(Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)，在外源刺激下宿主細(xì)胞可通過募集LC3向單層膜吞噬泡的聚集，從而提高其吞噬和殺傷病原體的效率，即LC3相關(guān)吞噬作用(LC3-associated phagocytosis, LAP)。研究表明，LAP 在清除病原微生物感染過程中具有非常重要的作用，其作用機(jī)制不同于傳統(tǒng)的吞噬作用和自噬作用。本文重點(diǎn)對現(xiàn)有研究中的真菌感染引起的細(xì)胞自噬和LAP相關(guān)的過程進(jìn)行綜述。

1 自噬與LAP的差異

1.1 自噬

細(xì)胞自噬是細(xì)胞中受損、變性或衰老的各種蛋白質(zhì)及外來入侵物、細(xì)胞器等被自噬體包裹并運(yùn)送到溶酶體內(nèi)進(jìn)行消化并降解的過程,通過維持細(xì)胞存活和調(diào)節(jié)炎癥來保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔方式的不同，哺乳動物細(xì)胞自噬可分為巨自噬(macroautophagy)，分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)和微自噬(microautophagy)3種主要方式[2]。在哺乳動物細(xì)胞中，巨自噬(本文稱為“自噬”)通過形成自噬體的雙膜囊泡固定受損的細(xì)胞器，蛋白質(zhì)聚集體或入侵的病原體以進(jìn)行降解。并且，自噬已經(jīng)在各種免疫細(xì)胞中廣泛研究，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞[3-4]。自噬可以通過各種誘導(dǎo)(例如饑餓、高溫、低氧、外來微生物及其毒素作用等)啟動，這些因素通過抑制mTOR來被轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)分隔膜或“吞噬泡”的形成。該過程通過III類PI3K復(fù)合體(包括VPS34、Beclin-1)的聚集而促進(jìn)自噬體的形成。自噬的發(fā)生受自噬相關(guān)蛋白(autophagy-related，Atg)的調(diào)控，Atg參與自噬的不同階段，Atg12-Atg5-Atg16L1蛋白體復(fù)合物存在于外膜上，LC3-II存在于分隔膜的內(nèi)膜和外膜上，其中LC3-II是細(xì)胞自噬過程中重要的標(biāo)志蛋白[5]。除了維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用外，自噬最近被認(rèn)為對病毒、細(xì)菌和原生動物具有免疫抑作用[6]。在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的病原體，如Sindbis病毒[7]或單核細(xì)胞增生李斯特菌[8]，其周圍自噬體的形成導(dǎo)致其通過溶酶體降解而清除。總體而言，自噬是一種動態(tài)過程，不僅在基礎(chǔ)水平上維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，還可通過細(xì)胞應(yīng)激而誘導(dǎo)發(fā)生。

1.2 LAP

LAP是一種非典型性吞噬作用，其特點(diǎn)是在單層膜的吞噬泡上發(fā)現(xiàn)了LC3的存在, 該過程被激活后LC3被招募至吞噬體, 加速吞噬泡的成熟, 促進(jìn)吞噬泡與溶酶體的融合以及抗原呈遞作用, 提高機(jī)體的天然免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)的效率, 從而更快地殺滅病原體[9]。LAP和細(xì)胞自噬過程很相似，啟動都需要ROS和PI(3)P，需要共用許多蛋白，如Beclin-1、Atg3、Atg5和Atg7等，因此，ATG5或ATG7的敲除可顯著降低吞噬體周圍LC3的水平，使哺乳動物或細(xì)胞不能同時進(jìn)行LAP和自噬[10-11]。不同于傳統(tǒng)自噬中LC3與雙膜自噬體相結(jié)合，在LAP中，LC3直接被招募到單膜吞噬體中[11-12]，需要Rubicon和NOX2，不需要由ULK1 / 2、FIP200和ATG13組成的自噬預(yù)起始復(fù)合物[10,13,14]。由于LC3是自噬和LAP共有的蛋白，所以很多關(guān)于微生物感染清除機(jī)制的研究并不能確定是自噬還是LAP在發(fā)揮作用[15]。

表1 自噬與LAP的特征比較[16]

2 LAP在真菌感染中的作用

由于殺滅病原體的效率較高，LAP被認(rèn)為是機(jī)體天然免疫反應(yīng)的重要組成部分，可以參與應(yīng)對多種病原體的感染過程。近年來，LAP與常見病原菌白念珠菌、煙曲霉及新生隱球菌等感染的研究越來越多。

2.1 白念珠菌(Candida albicans)

作為控制白念珠菌感染的主要免疫細(xì)胞群，固有免疫細(xì)胞通過吞噬作用清除真菌并通過Dectin-1識別白念珠菌壁表面表達(dá)的β-1,3-葡聚糖來產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子。Ma等[17]的研究顯示，不同細(xì)胞類型間吞噬體成熟的差異可能導(dǎo)致LC3聚集的結(jié)果不相同。在樹突狀細(xì)胞中，真菌抗原觸發(fā)Dectin-1導(dǎo)致LC3聚集到含有白念珠菌的吞噬體周圍，盡管該途徑在 TNF-α和IL-6的產(chǎn)生及對白念珠菌的殺傷方面無差異[18]，但確實(shí)促進(jìn)了MHC II類真菌抗原的呈遞。與樹突狀細(xì)胞的結(jié)果相反，巨噬細(xì)胞中的研究顯示LC3β-/-和野生型原代巨噬細(xì)胞在TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生及白念珠菌的存活方面存在差異，真菌吞噬體周圍LC3的聚集對巨噬細(xì)胞的殺真菌活性和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)都有重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Dectin-1觸發(fā)的LC3聚集及LAP過程均需要Syk磷酸化和NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS[18-20]。最近，有研究揭示了經(jīng)典自噬和LAP在對抗白念珠菌攻擊中的協(xié)調(diào)機(jī)制，Duan等[21]的研究表明在巨噬細(xì)胞中白假絲酵母可抑制LC3轉(zhuǎn)換，其吞噬作用會降低自噬通量。此外，研究還驗(yàn)證了LC3聚集是檢測LAP誘導(dǎo)的關(guān)鍵方法，但由于LAP過程中是否發(fā)生了LC3轉(zhuǎn)換尚不清楚，因此在研究LAP過程時，應(yīng)避免進(jìn)行LC3-I至LC3-II轉(zhuǎn)化和LC3-II轉(zhuǎn)換的測定。然而，很多白念珠菌在LAP過程中的分子細(xì)節(jié)尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。

2.2 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)

除白念珠菌外，最新的數(shù)據(jù)表明，LAP在控制最常見的霉菌感染煙曲霉中也起著重要作用。與酵母菌不同，許多霉菌感染的發(fā)病機(jī)理是通過分生孢子或孢子的肺暴露。Kyrmizi等[22]使用人單核細(xì)胞和煙曲霉分生孢子共培養(yǎng)，結(jié)果顯示只有活的煙曲霉分生孢子才能在吞噬作用后2～4 h引發(fā)LC3-II形成峰值；而Martinez等[10]對Rubicon缺陷小鼠的研究表明LC3的募集和清除是由LAP介導(dǎo)，而非自噬。研究人員證明對煙曲霉的殺傷需要功能性LAP，缺乏Rubicon、Beclin-1、NOX2或Atg7的巨噬細(xì)胞能夠吞噬等量的煙曲霉分生孢子，但沒有將LC3募集到吞噬體中，研究者對Beclin-1flox/flox, Rubicon-1- / -和Atg7flox/flox小鼠鼻內(nèi)接種煙曲霉，與野生型對照組相比，在LAP缺陷小鼠中IL-1、IL-6、IL-12和TNF-的顯著增加[10]。LAP通過抑制促炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)和肺中肉芽腫的形成來保護(hù)小鼠免受肺曲霉病的侵襲。LAP還可以穩(wěn)定NOX2 NADPH氧化酶復(fù)合物以產(chǎn)生ROS。由此可見，LAP在宿主細(xì)胞清除曲霉中起關(guān)鍵作用[10]。

2.3 新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)

Qin等[23]通過對果蠅S2細(xì)胞的研究證明宿主細(xì)胞感染新生隱球菌需要自噬蛋白(包括Atg2a、Atg5和Atg9a)和III類PI3-激酶活性，該報告證明ATGs(ATG5、ATG9a和ATG12)參與但非必需，在巨噬細(xì)胞中新生隱球菌被RAW264.7吞噬，蛋白質(zhì)聚集在含有新生隱球菌空泡附近。感染15 h后，ATG2a、ATG5、ATG9a、ATG12和LC3增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞內(nèi)新生隱球菌的胞內(nèi)復(fù)制和從空泡中逃逸。另一篇文章報道了內(nèi)源性隱球菌孢子的LC3聚集，在骨髓細(xì)胞中條件性敲除ATG5并沒有改變隱球菌感染小鼠的存活率，然而，基因敲除小鼠表現(xiàn)出肺部真菌負(fù)荷的減少和MIP-1α(CCL3)、IP-10(CXCL10)蛋白以及2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13(50)表達(dá)量的降低，但I(xiàn)FN-γ和IL-17的表達(dá)似乎沒有改變[24]。因而，有待進(jìn)一步研究以更好地了解LAP在隱球菌感染中的作用。

3 小 結(jié)

LAP是細(xì)胞對病原微生物感染的一種免疫應(yīng)答方式，通過將LC3錨定在吞噬泡上加速與溶酶體的融合而提高殺菌效率。近年來，在宿主對病原真菌免疫應(yīng)答的背景下，真菌感染免疫也被重新定義，由于自噬及LAP的相繼提出，仍有很多問題需要探究，例如，自噬與LAP是否可以相互轉(zhuǎn)化；LC3的出現(xiàn)是自噬的指標(biāo)還是LAP在發(fā)揮作用；LAP的發(fā)生機(jī)制；還有哪些分子參與LAP過程等等?？傊?，該領(lǐng)域持續(xù)研究將揭示自噬及LAP在宿主真菌免疫中發(fā)揮作用的新途徑，且可能成為新的抗真菌治療的靶點(diǎn)。