涂曉萌，郭志強(qiáng)，李 雪

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州325027）

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD），又稱孤獨(dú)性障礙或自閉癥，是一類復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育疾病，在兒童中發(fā)病率高達(dá)1%～3%［1-2］。ASD致病原因相對(duì)復(fù)雜，并非單一致病機(jī)制的簡(jiǎn)單失調(diào)，多認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的［3-4］。家族和雙胞胎的研究分析表明，同卵雙生的共患病率高達(dá)70%～90%，說(shuō)明遺傳因素在ASD的發(fā)生中起著重要作用［5］。來(lái)自父母及患病兒童的全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，ASD患者中存在多個(gè)新生突變［6-9］。因此，針對(duì)臨床ASD風(fēng)險(xiǎn)基因的生物學(xué)功能研究，以及相關(guān)突變?cè)诖竽X發(fā)育中的作用分析，將有助于揭示ASD的潛在致病機(jī)制。

研究表明，眾多自閉癥相關(guān)基因主要通過調(diào)控早期大腦正常發(fā)育而發(fā)揮作用［10-11］。ASD被認(rèn)為與早期大腦發(fā)育異常有關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子在這一過程中起到關(guān)鍵作用，可以調(diào)控相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)［12］。因此，鑒別在ASD發(fā)病以及大腦發(fā)育過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于解析自閉癥發(fā)病機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。轉(zhuǎn)錄因子FOX家族的成員已被證實(shí)與ASD密切相關(guān)［13-14］。在多名ASD患者中發(fā)現(xiàn)FOXP1雜合子的缺失、點(diǎn)突變以及復(fù)制異常［15-17］。大規(guī)模外顯子測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)OXP1是多名ASD患者中的新生突變基因［18］，這使得FOXP1躋身成為ASD的高風(fēng)險(xiǎn)基因。

為了探索FOXP1突變導(dǎo)致ASD發(fā)生的作用機(jī)制，本課題克隆了小鼠Foxp1基因的突變體Y435X（蛋白序列比對(duì)等同于人Y439X），利用多種分子生物學(xué)技術(shù)，分析該突變體在細(xì)胞中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位，以及在體異位表達(dá)對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元最終定位和形態(tài)發(fā)生的影響。通過對(duì)Foxp1突變體蛋白本身的功能研究，為自閉癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機(jī)理研究開拓了新思路。

材料和方法

1 細(xì)胞與動(dòng)物

小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞資源中心。原代神經(jīng)元于無(wú)菌條件下取自胚胎期ICR小鼠大腦皮質(zhì)。清潔級(jí)ICR小鼠來(lái)自并繁殖于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物合格證編號(hào)為SYXK（浙）2020-0014。小鼠繁育主要通過當(dāng)天晚上合籠，第2天分籠的方式，見栓則記為胚胎0.5 d（E0.5）。所有操作都嚴(yán)格遵循溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)管理?xiàng)l例進(jìn)行。該研究本著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理的原則，優(yōu)化設(shè)計(jì)方案，嚴(yán)格計(jì)劃動(dòng)物需要數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，戊巴比妥鈉麻醉小鼠（50 mg/kg），使小鼠安樂死。

2 主要試劑

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 胎牛血清、0.25%trypsin-EDTA、HBSS和DMEM購(gòu)自Gibco；青、鏈霉素購(gòu)自Sigma；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和 表 皮 生 長(zhǎng) 因 子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自R&D；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購(gòu)自上海生工公司。

2.2 主要試劑 驢血清購(gòu)自Jackson ImmunoRe‐search；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自Cell Signaling Technology；glycine、L-lysine和Triton X-100購(gòu)自Sigma；PBS購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN；Power SYBR?Green PCR Master Mix購(gòu)自Life Technologies；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；β-巰基乙醇和萊普霉素B（leptomycin B，LMB）購(gòu)自碧云天公司；多聚甲醛購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；Opti-MEM和Lipofectamine 3000購(gòu)自Invitrogen；點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自天根生化科技有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱和Automated Cell Counter（Invitrogen）；P-97拉針儀（SUTTER）；Electro Square Porator電擊儀（BTX）；HM505E冰凍切片機(jī)（MICROM）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss LSM 710）；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 N2a細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和1%青、鏈霉素的DMEM中。細(xì)胞置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。利用小鼠大腦cDNA文庫(kù)通過PCR擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)Foxp1。Foxp1的上游引物序列為5'-ATGCAAGAATCTGGGTCTGAGAC-3'，下游引物序列為5'-GGTTCACTCCATGTCCT‐CATTTACTG-3'。通過EcoR I和NotI酶切位點(diǎn)將基因克隆到pCAGEN的載體上，得到Foxp1-pCAGEN。通過PCR將V5（GKPIPNPLLGLDST）標(biāo)簽克隆到Foxp1-pCAGEN N端，得到V5-Foxp1-pCAGEN。在V5-Foxp1-pCAGEN上采用點(diǎn)突變?cè)噭┖?，引入Y435X點(diǎn)突變，得到V5-Foxp1-Y435X-pCAGEN。使用Lipofectamine 3000將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到N2a細(xì)胞中。

3.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 使用含有蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，BCA法檢測(cè)各蛋白濃度，加入loading buffer煮5 min后置于?20℃儲(chǔ)存。按照Western blot步驟對(duì)蛋白樣品電泳及電轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入Ⅰ抗［抗V5抗體（1∶5 000，Abcam）和抗α-tubulin抗體（1∶5 000，Sigma）］4℃孵育過夜，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，最后采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。條帶經(jīng)掃描后，采用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics）進(jìn)行灰度值計(jì)算分析。

3.3 子宮內(nèi)胚胎基因轉(zhuǎn)染 用子宮內(nèi)胚胎基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腦皮質(zhì)前體細(xì)胞中。按劑量對(duì)孕鼠進(jìn)行腹腔麻醉，腹部用70%酒精消毒。沿腹中線從上至下切開3～5 cm，打開孕鼠腹腔，輕輕取出子宮。挑選其中一個(gè)胚胎的頭部，微玻針吸取電轉(zhuǎn)質(zhì)粒（4 g/L，約0.5μL）經(jīng)孕鼠腹腔刺入胚胎側(cè)腦室；指示質(zhì)粒（pCAGGS-GFP）∶目的質(zhì)粒（pCAGEN或pCAGEN-V5-Y435X）=1∶5（體積比）。用電極緊夾吹入質(zhì)粒后的胎鼠頭部，質(zhì)粒側(cè)貼放正極，開始電擊：電壓38 V，間隔50 ms，共5個(gè)pulse。電擊操作完后把子宮放回腹腔，醫(yī)用縫合線逐層縫合腹膜及皮膚。用加熱光源照射孕鼠供暖促進(jìn)蘇醒，孕鼠蘇醒后送回清潔動(dòng)物房飼養(yǎng)。

3.4 細(xì)胞免疫熒光 4%多聚甲醛室溫固定N2a細(xì)胞或原代神經(jīng)元15 min，0.3%Triton X-100破膜5 min，1×PBS洗2遍后加入適量的封閉液；室溫孵育1 h；加入Ⅰ抗［抗V5抗體和抗核纖層蛋白B（lamin B）抗體，1∶500，Abcam］，37℃孵育1 h；1×PBS洗3遍后，加入Ⅱ抗，37℃孵育1 h。免疫熒光圖片通過Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡獲得。

3.5 組織免疫熒光 小鼠用4%多聚甲醛灌注固定。取出相應(yīng)時(shí)間的小鼠大腦，用4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛后固定4 h至過夜（胚胎小鼠大腦固定4 h，成年小鼠大腦固定過夜）。標(biāo)本加入30%蔗糖溶液脫水，用OCT包埋。使用HM505E冰凍切片機(jī)制作冰凍切片（厚度14μm）。免疫染色：大腦切片，加Ⅰ抗［抗V5抗體（1∶500，Abcam）、抗lamin B抗體（1∶500，Abcam）、抗GFP抗體（1∶1 000，Novus Biologicals）和抗GM130抗體（1∶300，Sigma）］4℃過夜；加Ⅱ抗，室溫孵育2 h。免疫熒光圖片通過Zeiss LSM 710共聚焦顯微鏡獲得。皮層分區(qū)通過DAPI染色確定。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Figure 1.Cytoplasmic expression of Foxp1 Y435X mutant in N2a cells.A：lysates of the N2a cells transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X were immunoblotted with V5 andα-tubulin antibodies；B：immunofluorescence staining of N2a cells was performed after transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X for 48 h.Nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=20μm.Ar‐rows indicated the nuclear location of WTFoxp1.Arrowheads marked the cytoplasmic aggregates of Y435X.圖1 Foxp1 Y435X突變體在N2a細(xì)胞中的表達(dá)及定位

數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。顯著性差異分析用SPSS11.5軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Foxp1 Y435X突變體在N2a細(xì)胞中的表達(dá)及定位

Y439X是一個(gè)人類FOXP1的無(wú)義突變體，可以在亮氨酸拉鏈區(qū)和FOX DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間截短，產(chǎn)生一個(gè)突變蛋白。為了探索FOXP1突變體Y439X的功能，我們首先克隆了小鼠的全長(zhǎng)Foxp1及其突變體Y435X，分別連接V5的標(biāo)簽。隨后，在N2a細(xì)胞中檢測(cè)Y435X的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，V5-Y435X產(chǎn)生一個(gè)大約56 kD的截短蛋白，與全長(zhǎng)Foxp1相比，表達(dá)量明顯增加（圖1A）。小鼠Foxp1與人類FOXP1相似，擁有2個(gè)保守的核定位信號(hào)，以及一個(gè)潛在的核輸出信號(hào)。Y435X突變所截短的蛋白位于第1個(gè)核定位信號(hào)后，丟失了全部的FOX區(qū)域和第2個(gè)核定位信號(hào)。為了確定突變體的亞細(xì)胞定位，我們?cè)贜2A細(xì)胞中利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)V5-Y435X的表達(dá)。野生型Foxp1連接V5的標(biāo)簽，蛋白表達(dá)定位在細(xì)胞核；而突變體Y435X連接V5的標(biāo)簽，表現(xiàn)出異常的亞細(xì)胞定位，在胞質(zhì)中呈彌散性分布，并形成聚集物（圖1B）。這一發(fā)現(xiàn)與之前人類FOXP1 Y439X突變體無(wú)法定位核中，而在胞質(zhì)產(chǎn)生聚集體的結(jié)果相一致［19］。以上結(jié)果說(shuō)明Y435X突變后產(chǎn)生一個(gè)截短蛋白，并使得其亞細(xì)胞定位發(fā)生改變，這與其中一個(gè)核定位信號(hào)丟失有關(guān)。

2 Foxp1 Y435X突變體在N2a細(xì)胞中誘發(fā)核膜皺縮

蛋白質(zhì)聚集與許多病理?xiàng)l件有關(guān)，包括幾種神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病，以及Ⅱ型糖尿病或傳染性海綿狀腦病。神經(jīng)退行性疾病患者神經(jīng)元中形成蛋白聚集體，可能會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)高度保守的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（nucleo-cytoplasmic transport，NCT）功能［20-21］，這一機(jī)制可以保證核酸和蛋白運(yùn)輸順利通過核膜，是神經(jīng)元最基礎(chǔ)的信號(hào)通路。核膜主要在維持核形態(tài)、錨定核孔復(fù)合物、染色體組織及啟動(dòng)DNA損失修復(fù)中發(fā)揮作用［22］。研究顯示核膜及核孔的損傷與神經(jīng)退行性疾病以及生理狀態(tài)下神經(jīng)元衰老有關(guān)［23］。本實(shí)驗(yàn)在N2a細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染V5-Y435X或V5-Foxp1，利用lamin B抗體標(biāo)記核膜上的核纖層蛋白，分析Y435X突變形成的聚集體是否會(huì)導(dǎo)致核膜形態(tài)異常。免疫熒光結(jié)果顯示，對(duì)照V5-Foxp1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞核膜完整，呈現(xiàn)圓潤(rùn)的環(huán)形結(jié)構(gòu)；而表達(dá)Y435X突變體的細(xì)胞核膜發(fā)生了皺縮，呈多褶皺狀，見圖2。

Figure 2.Foxp1 Y435X mutant induced nuclear membrane shrinkage in N2a cells.The N2a cells were transfected with V5-Foxp1 or V5-Y435X for 48 h.To visualize the nuclear morphological changes of the transfected cells，immunofluorescence staining of lamin Bwas performed.Nuclei were stained with DAPI（blue）.The scale bar=5μm.圖2 Foxp1 Y435X突變體在N2a細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)核膜皺縮

Foxp1含有一個(gè)潛在的核輸出信號(hào)，可以通過核輸出的選擇性抑制劑使其滯留在核中［24］。Y435X突變體可能由于蛋白錯(cuò)誤折疊而暴露其核輸出信號(hào)，使得聚集體在胞質(zhì)中易位表達(dá)。為了證實(shí)Y435X對(duì)NCT的影響，我們?cè)谵D(zhuǎn)染V5-Y435X的N2a細(xì)胞中加入核輸出阻斷劑LMB，利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Y435X突變體的表達(dá)。結(jié)果顯示，加入對(duì)照溶劑的轉(zhuǎn)染組中，Y435X突變體主要在胞質(zhì)中表達(dá)并形成聚集體；而當(dāng)加入LMB后，Y435X突變體在胞核和胞質(zhì)中均表達(dá)，見圖3。以上結(jié)果說(shuō)明，Y435X聚集體可能通過核膜損傷而影響NCT，最終誘發(fā)ASD的發(fā)生。

3 Foxp1 Y435X突變體在原代皮質(zhì)神經(jīng)元中的表達(dá)和定位

為了確認(rèn)Foxp1 Y435X突變體的在體表達(dá)情況，我們將pCAGEN-V5-Y435X或pCAGEN與指示質(zhì)粒pCAGGS-GFP混合，再通過胚胎基因轉(zhuǎn)染的方法，共同導(dǎo)入E14.5小鼠側(cè)腦室。在E16.5時(shí)，分離轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的大腦皮質(zhì)，制備成單細(xì)胞懸液，在24孔板中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，加入V5抗體，利用免疫熒光檢測(cè)Y435X的表達(dá)情況。如圖4所示，Y435X突變體不僅在神經(jīng)元胞體的胞質(zhì)中呈聚集體樣表達(dá)，還存在于分化的突起上。這表明Foxp1 Y435X突變體可能對(duì)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生產(chǎn)生一定的影響。

4 Foxp1 Y435X突變體干擾皮質(zhì)神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)的最終定位

神經(jīng)元遷移到特定位置后，皮質(zhì)分層建立，這一過程受多種胞外和胞內(nèi)信號(hào)調(diào)節(jié)的肌動(dòng)蛋白及微管骨架控制［25］。為了明確Foxp1 Y435X突變體對(duì)皮質(zhì)分層的影響，我們采用胚胎基因轉(zhuǎn)染將Y435X質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到E14.5的胚胎小鼠皮質(zhì)前體細(xì)胞中。P2時(shí)取腦，切片觀察GFP陽(yáng)性神經(jīng)元是否存在滯留（分層異常）。在正常情況下P2的皮質(zhì)神經(jīng)元已完成了徑向遷移，對(duì)照組的GFP陽(yáng)性神經(jīng)元大多數(shù)已經(jīng)遷移至Ⅱ～Ⅳ層，只有少量的細(xì)胞還存在Ⅴ～Ⅵ層和白質(zhì)；轉(zhuǎn)染Y435X后，只有不足60%的細(xì)胞位于Ⅱ～Ⅳ層，而大量GFP陽(yáng)性神經(jīng)元異常定位于Ⅴ～Ⅵ層和白質(zhì)，見圖5。以上結(jié)果表明，雖然Y435X突變對(duì)早期神經(jīng)元徑向遷移無(wú)影響，但是對(duì)神經(jīng)元的最終定位——皮質(zhì)分層存在明顯的干擾作用。

5 Foxp1 Y435X突變體對(duì)皮質(zhì)分層的影響具有長(zhǎng)期效應(yīng)

為了確定Y435X突變誘發(fā)的神經(jīng)元異位是否具有長(zhǎng)期效應(yīng)，我們將E14.5電轉(zhuǎn)的小鼠在出生后P8和P16時(shí)取腦，切片分析GFP陽(yáng)性神經(jīng)元在皮質(zhì)各層的分布。與上述P2時(shí)期結(jié)果相似，P8和P16時(shí)期對(duì)照組的GFP陽(yáng)性細(xì)胞大多存在第Ⅱ～Ⅳ層，而表達(dá)V5-Y435X的細(xì)胞在Ⅱ～Ⅳ層中的比例顯著減少，Ⅴ～Ⅵ層中的異位神經(jīng)元明顯增加，見圖6。這些數(shù)據(jù)表明，Y435X突變對(duì)皮質(zhì)中神經(jīng)元的定位和分層具有長(zhǎng)期效應(yīng)。

Figure 3.Nucleo-cytoplasmic transport was responsible for the cytoplasmic distribution of Foxp1 Y435X mutant.The N2a cells was transfected with V5-Y435X.After 48 h，the cells were treated with solvent ethanol or 2μg/L leptomycin B（LMB）for 3 h.To visualize the distribution of the transfected cells，immunofluorescence staining of V5 was performed.Nuclei were stained with DAPI（blue）.Arrows indicated the cytoplasmic location of Y435X.Arrowheads marked the nuclear and cyto‐plasmic expression of Y435X.The scale bar=50μm.圖3 Foxp1 Y435X突變體在胞質(zhì)異常定位與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)

Figure 4.Foxp1 Y435X mutant induced aggregates in the embryonic cortical neurons.E14.5 mouse embryos were electroporated with pCAGEN or V5-Y435X-pCAGEN，together with pCAGGS-GFP.After 48 h，single cell suspensions were prepared from the transfected brain，and the cells were attached on coverslips for immunofluorescence detection of V5（red）.Arrows indicated the differentiated neurites expressing Y435X.Nucleiwere stained with DAPI（blue）.Thescale bar=20μm.圖4 Foxp1 Y435X突變體在原代皮質(zhì)神經(jīng)元中誘導(dǎo)聚集物形成

6 Foxp1 Y435X突變體對(duì)深層異位神經(jīng)元頂樹突方向的影響

Figure 5.Foxp1 Y435X mutant altered the neuron positioning after birth.E14.5 mouse embryos were electroporated with pCAGEN（A）or V5-Y435X-pCAGEN（B），together with pCAGGS-GFP.Brains were harvested at P2.Nuclei were counterstained with DAPI（blue）.The scale bar=100μm.C：statistical analysis of the percentages of GFP-positive cells that had reached the indicated regions of the cerebral cortex.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pCAGENgroup.圖5 Foxp1 Y435X突變體對(duì)出生后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元最終定位的影響

大部分上皮層錐體神經(jīng)元在P2時(shí)完成遷移，到達(dá)最終位置的神經(jīng)元形成樹突和軸突，再與其他神經(jīng)元一起發(fā)育出有功能的突觸。錐體神經(jīng)元的樹突又可以進(jìn)一步細(xì)分為朝向軟腦膜表面生長(zhǎng)的頂樹突，以及從胞體發(fā)出的具有多個(gè)分支的基樹突［26-27］。樹突作為神經(jīng)元的主要結(jié)構(gòu)，可以接收來(lái)自其他神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的信息輸入。因此，樹突的形態(tài)是神經(jīng)系統(tǒng)功能正常發(fā)揮的決定性因素。在前期實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，P2時(shí)期滯留在第Ⅴ～Ⅵ層的細(xì)胞形態(tài)存在異常，其頂樹突方向似乎并未朝向軟腦膜生長(zhǎng)（圖7A）。為了確定這一現(xiàn)象，我們通過胚胎基因轉(zhuǎn)染將Y435X質(zhì)粒DNA導(dǎo)入E14.5的胚胎小鼠大腦皮質(zhì)前體細(xì)胞中。在P2取腦，切片，利用GM130抗體（標(biāo)記高爾基復(fù)合體基質(zhì)）進(jìn)行免疫熒光染色，分析Y435X表達(dá)對(duì)異位神經(jīng)元頂樹突方向的影響。通常情況下高爾基復(fù)合體位于朝向軟腦膜表面生長(zhǎng)的頂樹突中［27］。滯留在第Ⅴ～Ⅵ層的神經(jīng)元只有（38.37±2.57）%的頂樹突朝向軟腦膜生長(zhǎng)，而方向異常的滯留神經(jīng)元比例可以高達(dá)（64.57±2.70）%，見圖7B、C。以上結(jié)果說(shuō)明，在大腦皮質(zhì)發(fā)育早期表達(dá)Y435X突變體將影響皮質(zhì)神經(jīng)元頂樹突的生長(zhǎng)方向，使其極性改變。

討 論

為了探索人類FOXP1 Y439X突變導(dǎo)致ASD發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制，我們首先克隆了小鼠Foxp1 Y435X突變體（根據(jù)蛋白序列比對(duì)，小鼠Y435X等同于人類Y439X），并在N2a細(xì)胞及原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元中利用免疫熒光檢測(cè)V5-Y435X的表達(dá)和定位。結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相同：Foxp1 Y435X突變體以聚集體的形式，在N2a細(xì)胞和小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元胞質(zhì)中表達(dá)，這可能與一個(gè)核定位信號(hào)的丟失有關(guān)。

正常的NCT是保證轉(zhuǎn)錄因子入核的基本過程。核孔蛋白復(fù)合物（nuclear pore complex，NPC）是完成NCT的必要且保守的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。分子量在40 kD、直徑在5 nm以下的小分子，可以相對(duì)自由地?cái)U(kuò)散通過NPC。相比之下，分子量相對(duì)較大的蛋白，則需要依靠高度精密調(diào)節(jié)的NCT機(jī)制［28］。即使NPC功能及完整性的微小損傷也將會(huì)逐漸積累，導(dǎo)致核蛋白在胞質(zhì)中堆積，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。蛋白聚集體是神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)獨(dú)特的病理學(xué)特點(diǎn)，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病和亨廷頓病在內(nèi)的多個(gè)神經(jīng)退行性疾病均與NCT信號(hào)通路缺陷有關(guān)［29-30］。細(xì)胞骨架異常、蛋白聚集體形成和氧化損傷都是神經(jīng)退行性疾病的共同特征，均能誘導(dǎo)NCT的缺陷，例如核膜上NPC的缺失、蛋白錯(cuò)誤定位以及核纖層異常等。在培養(yǎng)N2a細(xì)胞時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Y435X后48 h，有很多細(xì)胞崩解，隨后碎片化死亡。為了證實(shí)Y435X是否與NCT異常導(dǎo)致的細(xì)胞死亡有關(guān)，我們利用免疫熒光染色觀察突變體對(duì)N2a細(xì)胞核膜形態(tài)的影響，以及Y435X的表達(dá)是否與NCT異常有關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染Y435X突變體后，細(xì)胞中核膜出現(xiàn)皺縮，而當(dāng)加入LMB后，Y435X在核和胞質(zhì)均有表達(dá)。因此推測(cè)Y435X可能通過影響NCT，進(jìn)而導(dǎo)致ASD疾病的發(fā)生。后續(xù)我們還將利用多種方法，分析和檢測(cè)究竟哪些NPCs受到突變體的影響而發(fā)生定位的改變，借此進(jìn)一步證實(shí)Y435X與NCT之間的相互關(guān)系。

Figure 6.Foxp1 Y435X mutant had a long-term effect on the neuron positioning after birth in mice.The pCAGEN or V5-Y435XpCAGENalong with pCAGGS-GFPwas tranfected into the dorsal telencephalon of E14.5 mouse embryos.Brains were har‐vested at P8（A）and P16（B）.The percentages of GFP-positive cells that had reached the indicated regions of the cerebral cortex were calculated.Nuclei were counterstained with DAPI（blue）.The scale bar=50μm.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs pCAGENgroup.圖6 Foxp1 Y435X突變體對(duì)出生后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元最終定位的長(zhǎng)期影響

完成細(xì)胞內(nèi)初步功能分析后，我們又進(jìn)行了突變體Y435X在大腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育中作用的在體研究。通過子宮內(nèi)胚胎基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在E14.5胚胎小鼠大腦皮質(zhì)中過表達(dá)Y435X。P2時(shí)結(jié)果表明，Y435X在神經(jīng)元定位中發(fā)揮作用，部分神經(jīng)元異位出現(xiàn)在第Ⅴ～Ⅵ層。進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的分析說(shuō)明，異位神經(jīng)元的頂樹突并未朝向軟腦膜表面，而是呈現(xiàn)出不規(guī)則的朝向。此外，定位改變還可以持續(xù)存在，直到P16，說(shuō)明突變體的影響并不是短暫可以修復(fù)的，而是具有長(zhǎng)期性的。神經(jīng)元遷移、定位及形態(tài)發(fā)生是神經(jīng)回路組裝的關(guān)鍵調(diào)控過程。在自閉癥患者的腦中，腦室周圍神經(jīng)元異常堆積（室周異位）經(jīng)常高比例出現(xiàn)［31］。后續(xù)可以采用離體腦片膜片鉗，評(píng)估異位神經(jīng)元的電生理功能。神經(jīng)元異位的機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，推測(cè)可能由于Y435X誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量聚集體，誘發(fā)NCT異常，進(jìn)而影響神經(jīng)元最終定位和形態(tài)發(fā)生，這可能是臨床上自閉癥相關(guān)FOXP1 Y439X突變癥狀出現(xiàn)的根本原因。對(duì)自閉癥相關(guān)Foxp1無(wú)義突變R521X（人類R525X）的研究表明，在胚胎發(fā)育早期過表達(dá)R521X可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞（括皮質(zhì)神經(jīng)元）發(fā)生自噬而非無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA降解，并干擾神經(jīng)元的徑向遷移［19］。因此，不同的ASD臨床表型，存在不同的致病機(jī)制，在未來(lái)的藥物靶點(diǎn)篩選時(shí)，需要采取不同的治療策略。

Figure 7.Foxp1 Y435X mutant altered the growth direction of apical dendrites in the cerebral cortex.A：V5-Y435X-pCAGEN along with pCAGGS-GFP was tranfected into the dorsal telencephalon of E14.5 mouse embryos，and brains were harvested at P2；B：the immunostaining of GM130（red）in ectopic neurons in the layersⅤ～Ⅵ；C：the proportion of the cells in the layersⅤ～Ⅵwith GM130 facing the pial surface as calculated from A.Arrows and arrowheads indicated the transfected neurons with or without apical dendrites facing to the pial surface，respectively.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs normal group.圖7 Foxp1 Y435X突變體對(duì)出生后小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元頂樹突方向的影響

本課題使用過表達(dá)的方法對(duì)小鼠Foxp1突變體的功能進(jìn)行研究，可以對(duì)基因敲除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充。傳統(tǒng)基因敲除動(dòng)物模型是假設(shè)雜合突變可以喪失一個(gè)等位基因，在體產(chǎn)生單倍體劑量不足的效應(yīng)，目的在于重現(xiàn)人類基因突變產(chǎn)生的表型。但在過表達(dá)Y435X的神經(jīng)元中，異常現(xiàn)象不可能僅由雜合缺失引起，而且有可能是由突變蛋白造成。Foxp1的蛋白高度保守，因此推測(cè)小鼠Y435X的人類同系物——FOXP1 Y439X突變體在人類大腦中可能會(huì)產(chǎn)生類似的作用，并且可以與FOXP1雜合缺失作用相疊加，加劇神經(jīng)元的發(fā)育障礙，從而導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育類疾病發(fā)生。