金 紅，張小燕，路宏科，殷 欣，張 輝，彭 濤

（甘肅省輕工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730000）

優(yōu)良的葡萄釀酒酵母應(yīng)具備起酵快，耐高酒精度、高SO2、高糖、高溫、低溫等特性，同時還應(yīng)能促使發(fā)酵進行徹底，實現(xiàn)酒體協(xié)調(diào)、易于長期儲存等。

葡萄酒釀造過程中，隨著發(fā)酵底物中酒精、糖、硫的濃度變化，酵母菌的耐受力會影響其生長及發(fā)酵活性。酒精濃度不斷增加，酵母的繁殖速度及存活率會急速下降[1]，殘?zhí)恰⑺釋绊懢频钠焚|(zhì)。已有研究者對外加酒精的培養(yǎng)基進行過酒精耐性對比試驗[2-3]。研究表明，酵母細胞內(nèi)細胞質(zhì)組成及水分活度會隨著高滲透脅迫而發(fā)生明顯變化，高鹽、高糖、高硫等發(fā)酵環(huán)境，常常會影響酵母菌的生長繁育[4]。因此，在葡萄濃醪發(fā)酵過程中，耐高滲酵母可以很好地應(yīng)用于釀酒工業(yè)。

本實驗對收集的廢酒糟酵母資源[5-6]進行系統(tǒng)實驗研究，篩選出耐高滲的釀酒酵母，應(yīng)用于葡萄酒釀造，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，旨在為高酒精度、無防腐劑的葡萄酒釀造選育優(yōu)良菌株提供理論依據(jù)，開辟葡萄酒研發(fā)新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鮮葡萄酒渣、鮮黃酒糟、鮮酒醅：某葡萄酒、黃酒、白酒生產(chǎn)企業(yè)提供；商業(yè)酵母BV818：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、酵母浸粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、硝酸鉀、硫酸銨、亞硫酸鈉、酒精、氯化鈉（均為分析純或生化試劑）：甘肅省石化物資貿(mào)易公司化玻儀器設(shè)備分公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集篩選培養(yǎng)基（1#培養(yǎng)基）：葡萄糖5%，酵母膏0.05%，KH2PO40.25%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，MgSO4·7H2O 0.1%，（NH4）2SO40.2%，滅菌后加Na2SO3至30 mg/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[7]（2#培養(yǎng)基）：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、牛肉膏10 g、蒸餾水1 000 mL，60 μg/mL鏈霉素；添加20 g/L瓊脂為固體培養(yǎng)基。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基（3#培養(yǎng)基）：酵母浸粉0.4%、胰蛋白胨0.5%、葡萄糖5%、瓊脂2%；儲液A：KH2PO45.5 g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，使用時按40 mL/1 000 mL添加[8]；儲液B：FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，使用時按1 mL/1 000 mL添加，調(diào)pH值至6.5，滅菌后加儲液C。儲液C：0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL體積分數(shù)50%的酒精溶液中，使用時按1 mL/1 000 mL添加。

發(fā)酵培養(yǎng)基[9]（4#培養(yǎng)基）：蔗糖20%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，酵母膏1%。

酵母氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基及酵母碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10]（5#培養(yǎng)基）：葡萄糖20.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母膏0.2 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

尿素基礎(chǔ)培養(yǎng)基（6#培養(yǎng)基）：蛋白胨1.0 g，NaCl 5.0 g，KH2PO42.0g，酚紅0.012g，瓊脂20.0g，pH6.8，蒸餾水1000mL。

蛋白胨水培養(yǎng)基（7#培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.6。

上述培養(yǎng)基均115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；AL204電子天平：德國METTLER TOLEDO公司；LDZX-75-KBS立式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；BK-3300生物顯微鏡：上海宙山精密光學儀器有限公司；600電熱恒溫水浴槽：北京科偉永興儀器有限公司；FDU-1200冷凍干燥機：EYELA東京理化器械株式會社；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；RE-3000 RE-10000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌分離純化

（1）樣品采集：將從相關(guān)企業(yè)分別采集的鮮酒醅、酒渣、酒糟，真空密封儲存于冰盒中，24 h內(nèi)送至實驗室，備用。

（2）菌株富集培養(yǎng)及分離純化：將采集到的酒醅、酒渣、鮮酒糟樣品分別稱取10 g，分別加入90 mL滅菌的1#培養(yǎng)基，28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)液用生理鹽水進行不同梯度稀釋后，涂布于2#培養(yǎng)基上分離，28 ℃培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)接并經(jīng)多次劃線純化，獲得純化菌株，接種于試管斜面，依次放入冰箱中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）將純化菌株活化后，劃線接種于WL培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7d，觀察記錄菌落的顏色及形態(tài)特征，進行分類鑒定。

1.3.2 菌株發(fā)酵特性

采用杜氏管法對分離得到的酵母菌進行發(fā)酵力測定，挑選發(fā)酵速度快、起發(fā)時間早及發(fā)酵氣味好的菌株。

酒精度耐受性測定：用杜氏管發(fā)酵法。將篩選出的酵母菌分別接入酒精度分別為12%vol、14%vol、16%vol、18%vol、20%vol的2#液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

糖度耐受性測定：用杜氏管發(fā)酵法。將篩選出的酵母菌分別接入葡萄糖含量分別為20%、30%、40%、50%、60%的2#液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

SO2濃度耐受性測定：用杜氏管發(fā)酵法。將篩選出的酵母菌分別接入SO2含量為100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L的2#液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置培養(yǎng)，每12 h觀察一次，記錄氣體充滿杜氏管的時間。

1.3.3 菌株模擬酒精發(fā)酵試驗

將篩選菌株轉(zhuǎn)接入4#培養(yǎng)基，28 ℃靜置發(fā)酵，至發(fā)酵液重量不再下降時為發(fā)酵終點。以商品酵母BV818作對照。

1.3.4 生理生化試驗

碳源同化試驗：將含有杜氏小管的試管滅菌后加入5#培養(yǎng)基3～4 mL，然后向其中半數(shù)的試管分別加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖作為碳源，調(diào)整糖濃度達到50mmol/L，滅菌[11]。將所有試管都接入供試菌，以沒有加碳源的試管作為對照，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察。如果試管出現(xiàn)渾濁為陽性，否則為陰性。

氮源同化試驗：將含有杜氏小管的試管滅菌后加入5#培養(yǎng)基3～4 mL，然后向其中半數(shù)的試管分別加入硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉作為氮源，調(diào)整氮源濃度達到50 mmol/L，滅菌。將所有試管都接入供試菌，以沒有加氮源的試管作為對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察。以試管中出現(xiàn)渾濁為陽性，否則為為陰性。

水解尿素試驗：試管中加入2.7 mL的6#基礎(chǔ)培養(yǎng)基，滅菌后，再向每支試管中加0.3 mL無菌水配制的20%已滅菌的尿素溶液，混合后擺斜面。挑取活化的菌株，接種于制好的斜面上，28 ℃培養(yǎng)，每天觀察結(jié)果，5～7 d后，若斜面呈現(xiàn)淡紅色，則說明此菌株能分解尿素。試驗重復(fù)3次[12]。

1.3.5 葡萄酒發(fā)酵試驗[13-18]

預(yù)試驗的結(jié)果顯示，高泡期流加濃縮汁底物濃度外觀糖偏低，以致最終發(fā)酵酒精度有所降低，因此調(diào)整葡萄酒發(fā)酵試驗方案為：初始底物濃度外觀糖為28%，提高高泡期補料后底物外觀糖至34%；接種量為106CFU/mL；菌株接種方式兩種：（1）釀酒酵母和膜醭畢赤氏酵母以70%∶30%、50%∶50%、30%∶70%體積比同時接入濃縮葡萄汁中；（2）發(fā)酵初期接種釀酒酵母，高泡期補料后接種膜醭畢赤氏酵母。20 ℃發(fā)酵15 d。

1.3.6 測定方法[19-23]

發(fā)酵力：采用CO2失質(zhì)量法；酒精度：采用密度瓶法；還原糖：采用直接滴定法；酸度：采用滴定法；香味：采用感官評定方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離純化

由表1可知，從鮮葡萄酒糟、鮮黃酒糟、鮮酒醅共分離純化出8株酵母菌，分別編號為A～H。

表1 酵母菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of yeast

2.2 菌株發(fā)酵特性及耐受性結(jié)果分析

2.2.1 菌株發(fā)酵特性

采用杜氏管法對分離得到的8株酵母菌進行發(fā)酵力測定，結(jié)果見表2。

表2 優(yōu)選菌株發(fā)酵特性試驗結(jié)果Table 2 Experimental results of fermentation characteristics of the preferred yeast strains

由表2可知，菌株A、B、C發(fā)酵速度最快；菌株A起發(fā)時間最短，為2 h，發(fā)酵具有濃郁的酒香味。

2.2.2 優(yōu)選酵母菌株的酒精、葡萄糖及SO2耐受性

由表3可知，酵母菌的生長繁殖隨著酒精含量的增高而受到抑制，酒精含量越高，酵母菌的生長繁殖越弱。菌株A、B對酒精的耐受度比較好，其中菌株B耐受20%vol酒精21.3 h，仍可以啟動發(fā)酵。

表3 酵母菌株酒精耐受性試驗結(jié)果Table 3 Alcohol tolerance test results of yeast

由表4可知，菌株A、B和D對于糖具有較好的耐受性，均可在耐受60%糖濃度的情況下21.5 h后可以啟動發(fā)酵。

表4 酵母菌株葡萄糖耐受性試驗結(jié)果Table 4 Glucose tolerance test results of yeast strains

由表5可知，菌株A、B、D表現(xiàn)出較強的SO2耐受性，均可在耐受300 mg/L SO2的情況下6.7 h后可以啟動發(fā)酵。綜合耐受性試驗結(jié)果，選擇菌株A、菌株B進行模擬酒精發(fā)酵試驗。

表5 酵母菌株SO2耐受性試驗結(jié)果Table 5 Sulfur dioxide tolerance test results of yeast strains

2.3 優(yōu)良菌株發(fā)酵試驗結(jié)果分析

由表6可知，菌株A產(chǎn)酒精度為10.8%vol，高于商品酵母BV818所產(chǎn)酒精度（9.2%vol），且產(chǎn)酒香氣較好，可作為優(yōu)良菌株保存；菌株B產(chǎn)酒精度9.2%vol與商業(yè)酵母BV818所產(chǎn)酒精度（9.2%vol）相當，也可作為優(yōu)良菌株保存。

表6 酵母菌株模擬酒精發(fā)酵試驗結(jié)果Table 6 Results of simulated alcoholic fermentation of yeast strains

2.4 生理生化鑒定

對菌株A、菌株B進行生理生化鑒定，結(jié)果見表7。由生理生化試驗結(jié)果可以初步鑒定菌株A、菌株B分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。

表7 菌株生理生化鑒定結(jié)果Table 7 Physiological and biochemical identification results of the strain

2.5 葡萄酒發(fā)酵試驗結(jié)果分析

由表8可知，在濃縮葡萄汁初始糖含量28%條件下接種菌株A，高泡期補料至含糖量34%接種菌株B，20 ℃發(fā)酵15 d，得到的葡萄酒酒精度最高，為18.1%vol。

表8 濃縮葡萄汁補料分期接入酵母菌株發(fā)酵結(jié)果Table 8 Fermentation results of concentrated grape juice feeding by stages with yeast strains

3 結(jié)論

該實驗從葡萄酒糟、黃酒糟、酒醅，經(jīng)過富集篩選分離純化得到8株酵母菌，經(jīng)高酒精度、高糖度、高SO2耐受試驗后初步篩選出2株菌株，一株耐高糖，在含糖量60%條件下21.5 h仍可啟動發(fā)酵；一株耐高酒精度，在酒精度20%vol條件下21.3 h仍可啟動發(fā)酵；2株菌株均可在300 mg/L SO2條件下在6.7 h啟動發(fā)酵。經(jīng)生理生化試驗初步鑒定兩株菌分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭畢赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。在濃縮葡萄汁初始糖含量28%條件下接種釀酒酵母，高泡期補料至含糖量34%接種膜醭畢赤氏酵母，20℃發(fā)酵15d，得到的葡萄酒酒精度為18.1%vol。通過本試驗為西北地區(qū)特色葡萄酒釀造提供了前瞻性的發(fā)酵菌株和工藝參數(shù)，以期為國內(nèi)特色葡萄酒產(chǎn)業(yè)做一些探索性的研究。