陳書程，陳 炯，酈特軍，鄭林燕，姚 瑤，王彩霞*

0 引言

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是常見的內(nèi)分泌疾病，影響了10%～25%的育齡婦女[1]，目前尚不清楚其病因和發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，胰島素抵抗在PCOS的發(fā)展中也發(fā)揮了作用。由于雄激素水平升高，PCOS患者的卵泡生成受損，可能出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)、多毛癥、痤瘡、脫發(fā)、不育或反復(fù)流產(chǎn)[2]。研究表明，PCOS患者的睪丸激素和黃體生成素濃度較高[3]。此外，大多數(shù)PCOS患者的肥胖和胰島素抵抗指數(shù)風(fēng)險(xiǎn)較高[4]。洋甘菊是南歐和東歐最常見的藥用植物之一，其主要活性成分包括酚類、類黃酮和植物雌激素[5-6]。洋甘菊提取物(Chamomile extract)具有抗炎、抗氧化、抗肝毒性、抗病毒、保護(hù)血管和解痙作用[7]。本研究觀察洋甘菊提取物對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠的子宮內(nèi)膜組織、胰島素抵抗和瘦素、血脂水平的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為臨床治療多囊卵巢綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只成年雌性Wistar大鼠(SPF級(jí)，180～200 g)購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(渝) 2019-0004]。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，自由飲食和進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)嚴(yán)格經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)審查。大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 洋甘菊提取物(HPLC≥98%)購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司，人絨毛促性腺激素(HCG)購(gòu)自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，胰島素購(gòu)自武漢優(yōu)爾生科技有限公司，黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、孕酮和雌二醇放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，胰島素放射免疫分析試劑盒購(gòu)自北京原子能生物研究所，瘦素、三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白試劑盒購(gòu)自深圳依諾金生物科技有限公司，HE染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多囊卵巢綜合征大鼠模型制備 按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行造模，每只大鼠皮下注射HCG 30 U，每日1次，共22 d；同時(shí)每天注射1次胰島素，第1～11天皮下注射0.5 U，之后逐漸增加劑量為6.0 U，并按此劑量維持至第22天。每天藥物注射結(jié)束后，進(jìn)行陰道涂片檢查，連續(xù)20 d，若大鼠完全失去動(dòng)情周期性變化，提示造模成功。

1.2.2 分組及給藥 ①分組：Wistar大鼠分為4組，假手術(shù)組(sham組)、多囊卵巢綜合征組(PCOS組)、洋甘菊提取物低劑量組(PCOS+CHA-L組)和洋甘菊提取物高劑量組(PCOS+CHA-H組)，每組15只，除sham組外,其余3組進(jìn)行造模。PCOS組、PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠按“1.2.1”進(jìn)行PCOS模型制作，sham組在相同時(shí)間皮下注射無(wú)菌生理鹽水，共22 d。選取造模成功的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②給藥方式：灌胃；給藥時(shí)間：造模結(jié)束后1 d，連續(xù)給藥30 d；給藥次數(shù)：1次/d。sham組：生理鹽水，4 ml/kg；PCOS組：生理鹽水，4 ml/kg；PCOA+CHA-L組：45 mg/kg的洋甘菊提取物，給藥體積為4 ml/kg；PCOS+CHA-H組：75 mg/kg的洋甘菊提取物，給藥體積為4 ml/kg。

1.2.3 取材 末次給藥2 h后，大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。待麻醉后，稱取大鼠體重，并于腹主動(dòng)脈取血，置于離心管中，3 000 r/min 離心15 min，吸取上層血清，于-80 ℃冰箱保存。摘除子宮組織，稱取子宮組織的重量，并于4%多聚甲醛溶液中固定；摘取胰腺組織，測(cè)量胰腺組織最寬和最窄部分取平均值，獲得胰島的直徑，并于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 血清樣本的檢測(cè) 取出-80 ℃保存的血清，置于冰上溶解。采用放射免疫分析法測(cè)定各組大鼠血清黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、孕酮和雌二醇的表達(dá)水平；采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定葡萄糖的表達(dá)水平；采用放射免疫分析法測(cè)定胰島素的表達(dá)水平，并根據(jù)公式計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)；ELISA法檢測(cè)血清中瘦素、三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 HE染色 取子宮組織和胰腺組織，并將其固定在4%多聚甲醛溶液中，在乙醇中脫水，二甲苯中透明，并制成5 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來(lái)水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度酒精中脫水，各5 min，再放入二甲苯I、II中透明，分別5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹膠封片，使用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

2 結(jié)果

2.1 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠體重和子宮指數(shù)的影響 如表1所示，與sham組相比，PCOS組大鼠體重和子宮指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠的體重和子宮指數(shù)下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠體重和子宮指數(shù)的變化(n=15)

2.2 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠血清中促性腺激素和性激素表達(dá)的影響 如表2所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清中黃體生成素表達(dá)水平和睪丸激素表達(dá)水平顯著上升(P<0.001)，卵泡刺激素表達(dá)水平和雌二醇表達(dá)水平明顯下降(P<0.01，P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清中黃體生成素表達(dá)水平和睪丸激素表達(dá)水平下降(P<0.05)，卵泡刺激素表達(dá)水平和雌二醇表達(dá)水平上升(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中促性腺激素和性激素的表達(dá)水平(n=15)

2.3 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠子宮組織病理變化的影響 大鼠子宮組織的病理學(xué)觀察見圖1，sham組中，子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，被單層柱狀上皮覆蓋；細(xì)胞核排列整齊，未見核固結(jié)或核碎裂。PCOS組中，子宮內(nèi)膜腺體增生，鏡下可見假塑性柱狀上皮，細(xì)胞核突出但大部分為碎片，在視野中可以看到炎性細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞；PCOS+CHA-L組中，子宮內(nèi)膜腺體輕度增生，腺體多為乳頭狀和管狀，細(xì)胞核排列整齊，但核仁不明顯，可見少量炎癥細(xì)胞；PCOS+CHA-H組中，子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，未見炎性細(xì)胞。

圖1 HE染色觀察各組大鼠子宮組織的病理變化(200×)

2.4 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠胰島組織病理變化的影響 大鼠胰島組織的病理觀察見圖2，在sham組中，大鼠胰島組織的形狀和結(jié)構(gòu)正常，并且細(xì)胞以緊湊和有序的方式排列；在PCOS組中，胰島組織出現(xiàn)異常病變，細(xì)胞排列疏松；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠胰島組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)趨于正常，細(xì)胞排列緊密。

圖2 HE染色觀察各組大鼠胰腺組織的病理變化(200×)

2.5 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠胰島素、葡萄糖表達(dá)水平和胰島素抵抗指數(shù)的影響 如表3所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)明顯升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

表3 各組大鼠胰島素、葡萄糖表達(dá)水平和胰島素抵抗指數(shù)的變化(n=15)

2.6 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠血清瘦素水平的影響 如表4所示，與sham組相比，PCOS組大鼠血清瘦素水平增加(P<0.05)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠血清瘦素水平下降(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清瘦素水平的變化(n=15)

2.7 洋甘菊提取物對(duì)各組大鼠血脂的影響 如表5所示，與sham組相比，PCOS組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯增加(P<0.01，P<0.01，P<0.001)，高密度脂蛋白含量明顯下降(P<0.01)；與PCOS組相比，PCOS+CHA-L組和PCOS+CHA-H組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯下降(P<0.05)，高密度脂蛋白含量增加(P<0.05)。

表5 各組大鼠血脂水平的變化(n=15)

3 討論

西醫(yī)認(rèn)為，遺傳因素、高黃體生成素、糖脂代謝異常、高胰島素血癥和胰島素抵抗、高雄激素血癥、低度炎癥反應(yīng)、肥胖、卵巢功能異常和青春期過(guò)度是PCOS的病因和發(fā)病機(jī)制[9-11]。

洋甘菊為菊科母菊屬德國(guó)洋甘菊，為菊科植物洋甘菊干燥的花或全草。洋甘菊具有降低血壓、降低膽固醇、發(fā)汗通便等功效[12]。研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物對(duì)小鼠有降血糖作用，并且能改善小鼠糖耐量，可用于臨床治療糖尿病[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物可使大鼠的體重和子宮指數(shù)下降，黃體生成素表達(dá)水平和睪丸激素表達(dá)水平下降，卵泡刺激素表達(dá)水平和雌二醇表達(dá)水平上升；也可使子宮內(nèi)膜腺體正常，乳頭狀排列，炎性細(xì)胞減少，也使胰島組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)趨于正常，細(xì)胞排列緊密。

胰島素抵抗在PCOS中發(fā)揮著重要作用，其中大約有45%～65%的患者均存在不同程度的胰島素抵抗，且PCOS患者患有2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[14]。研究顯示，黃酮類(如洋甘菊提取物)化合物具有降糖、改善胰島素抵抗、抑制相關(guān)葡萄糖代謝酶活性和抗糖尿病氧化損傷等作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)明顯升高，而洋甘菊提取物使大鼠血清胰島素含量、葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)降低，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

瘦素是一種由OB基因編碼的脂肪細(xì)胞衍生的激素，對(duì)嚙齒動(dòng)物的生殖功能有重要影響。循環(huán)中的瘦素水平與肥胖癥直接相關(guān)，而肥胖癥通常與PCOS有關(guān)，高胰島素血癥和胰島素抵抗通常與瘦素及其受體有關(guān)[16]。Rizk等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS與瘦素水平升高有關(guān)，表明了瘦素在PCOS發(fā)病機(jī)制中的作用。潘愛珍[8]等研究發(fā)現(xiàn)，蒼附導(dǎo)痰湯可通過(guò)降低體重、增加胰島素敏感性、調(diào)節(jié)瘦素、脂聯(lián)素和生殖激素的水平，從而改善大鼠生殖功能。本研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊提取物能降低胰島素抵抗指數(shù)，PCOS組大鼠血清瘦素水平增加，洋甘菊提取物使大鼠血清瘦素水平下降。

研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者同時(shí)患有高血壓和血脂異常的頻率明顯增加[18]，另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，患有PCOS的女性比健康女性的冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生率高63%[19]。因此，應(yīng)將血脂異常納入PCOS的日常健康治療方案中。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS組大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯增加，高密度脂蛋白含量明顯下降，洋甘菊提取物可使大鼠三酰甘油、膽固醇和低密度脂蛋白的含量明顯下降，高密度脂蛋白含量增加。

綜上所述，洋甘菊提取物可通過(guò)降低體重、子宮指數(shù)和胰島素抵抗指數(shù)，調(diào)節(jié)性激素、瘦素和血脂水平，從而改善PCOS大鼠的生殖功能。因此，洋甘菊提取物用作治療PCOS的可選藥物，可為臨床上治療PCOS提供新的理論依據(jù)。