潘金衛(wèi)， 鄧 磊， 王 偉， 楊文鵬， 任 洪， 柏光曉

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所， 貴陽(yáng) 550006)

玉米是世界上主要的飼料和糧食作物，其生長(zhǎng)發(fā)育受到各種環(huán)境因素的影響。其中干旱是影響玉米生長(zhǎng)的主要限制因素。中國(guó)是水資源十分短缺的國(guó)家之一，干旱、半干旱耕地面積占總面積的52.5%[1]，每年受旱面積達(dá)2.0×107～2.7×107hm2，平均每年玉米因干旱而造成的產(chǎn)量損失達(dá)15%～20%[2]。在我國(guó)西南地區(qū)，春旱和伏旱較為嚴(yán)重[3]，而玉米散粉吐絲期需水量較大，伏旱是導(dǎo)致減產(chǎn)最主要的因子之一。

為提高玉米的耐旱性，人們?cè)谀秃祷虮磉_(dá)[4]、耐旱相關(guān)基因的克隆及功能鑒定等方面做了大量的研究工作[5]，分離和鑒定了耐旱相關(guān)的一些候選基因及蛋白[6]，并對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化[7]。Mao等[8]在玉米第10染色體上的GRMZM2G127379(ZmNAC111)基因上游572 bp處啟動(dòng)子區(qū)發(fā)掘一個(gè)82 bp的MITE插入位點(diǎn)，普遍存在于溫帶玉米種質(zhì)中，而熱帶玉米種質(zhì)中缺失，并且證明與玉米苗期耐旱性有關(guān)。Wang等[9]發(fā)掘ZmVPP1基因組中的遺傳變異，并證明可以有效提高玉米苗期的耐旱性。玉米的耐旱性由數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL，Quantitative Trait Locus)控制[10]，目前，定位的耐旱QTLs涉及形態(tài)學(xué)性狀[11]、產(chǎn)量性狀及其產(chǎn)量構(gòu)成因子[12]、開(kāi)花-吐絲間隔期(ASI)[13]等，以及在干旱脅迫下可能產(chǎn)生遺傳變異的一些生理生化性狀[14]。 脫水素(dehydrin，DHN)是LEA蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一類(lèi)，它具有較強(qiáng)的親水性，在植物響應(yīng)非生物逆境環(huán)境如干旱、低溫凍害、高鹽堿等脅迫過(guò)程中起著重要的作用[15]。玉米中與脫水素有關(guān)的DHN基因有8個(gè)(http://www.maizegdb.org/)，對(duì)干旱脅迫處理表現(xiàn)出不同程度的響應(yīng)，其中，Zmdhn1和Zmdhn2基因在玉米各個(gè)組織中均有穩(wěn)定表達(dá)[16-18]，通過(guò)調(diào)控DHN基因的表達(dá)，可以顯著提高植物的抗逆性。Liu等[19]根據(jù)dhn1中的單核苷酸A/G多態(tài)性，開(kāi)發(fā)了CAPS 標(biāo)記dhnC 397，可以用于玉米的耐旱評(píng)估。這些研究均為利用分子標(biāo)記輔助選擇玉米耐旱種質(zhì)提供了可能。

為進(jìn)一步拓寬玉米耐旱性種質(zhì)資源，本研究以引進(jìn)的玉米耐旱材料和普通玉米自交系為試材，利用常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將耐旱主效基因dhn1與dhn2滲入到普通玉米材料中，以期獲得玉米耐旱性種質(zhì)，為玉米抗旱育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料與群體構(gòu)建

以2份引自CIMMYT的玉米耐旱材料，3份普通玉米自交系為試材，具體見(jiàn)表1。

利用耐旱性玉米材料和普通玉米自交系雜交獲得F1，用普通自交系回交獲得BC1F1，在BC1F1世代于盛花期進(jìn)行人工混合授粉(每個(gè)基礎(chǔ)群體混粉約50個(gè)單株)獲得BC1F1/S1，共構(gòu)建6個(gè)回交群體：CML 538/QR 273//QR 273、 CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC、CML 538/LX 9801//LX 9801、CML 539/QR 273//QR 273、CML 539/PH 6 WC//PH 6 WC、CML 538/LX 9801//LX 9801。

1.2 分子標(biāo)記

對(duì)于耐旱dhn1基因，參照柳思思等[20]開(kāi)發(fā)的功能性CAPS分子標(biāo)記dhnC 397進(jìn)行檢測(cè)，其中dhn1基因序列397位點(diǎn)發(fā)生了G與A的轉(zhuǎn)換，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)StyI酶切后，含有G位點(diǎn)的目的片段被酶切成131 bp和33 bp兩個(gè)片段，而含有A位點(diǎn)的由于缺少StyI酶切識(shí)別位點(diǎn)，因此不能被酶切，不被酶切的大片段與玉米的耐旱性關(guān)聯(lián)，被酶切的小片段與玉米的不耐旱性關(guān)聯(lián)。對(duì)于耐旱dhn2基因，選用與dhn2連鎖的SSR標(biāo)記umc 1634進(jìn)行檢測(cè)(表2)。

表2 耐旱基因及分子標(biāo)記信息

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用分子標(biāo)記輔助選擇的玉米微量DNA分離提取的CTAB法提取DNA[21]。用超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDropTMOne/OneC，產(chǎn)地美國(guó))檢測(cè)DNA的濃度與質(zhì)量，將DNA樣品濃度稀釋至10 ng·μL-1，-20 ℃下保存。

注：M為DL 2000 Marker；a為CML 538；b為CML 539；1為QR 273；2為PH 6 WC；3為L(zhǎng)X 9801。圖1 dhn1和dhn2目的基因標(biāo)記在親本之間的多態(tài)性Fig.1 Polymorphism of markers for dhn1 and dhn2 between parents

注：1為供體親本CML 538；2為輪回親本QR 273；3為3～32為世代群體的擴(kuò)增條帶。圖2 利用umc 1634標(biāo)記在玉米BC1F1/S1世代中部分單株擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of some single plants in maize BC1F1/S1 generation by umc 1634 marker

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(10 μL)：模板DNA 3 μL，10×Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1 μL，Glycerol(99%)1 μL，dNTP(2 mmol·L-1)0.75 μL，Primer(F+R)1.2 μL(5 μmol·L-1)，Taq(5 U·μL-1)0.075 μL，最后補(bǔ)ddH2O至10 μL。PCR擴(kuò)增程序在BIO-RAD C 1 000Thermal Cycler型擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?3 ℃預(yù)變性1 min；93 ℃變性1 min，58 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。針對(duì)dhn1基因，PCR反應(yīng)程序參照柳思思[20]的操作方法，PCR產(chǎn)物，利用限制性?xún)?nèi)切酶StyI進(jìn)行酶切，溫度為37 ℃，時(shí)間為4 h。用8%聚丙烯酰胺凝膠，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 靶基因選擇與背景分析

對(duì)BC1F1/S1分離世代，于苗期提取的基因組DNA，利用CAPS標(biāo)記dhnC 397，和SSR標(biāo)記umc 1634進(jìn)行靶基因選擇。對(duì)獲得的中選株系，用40對(duì)SSR標(biāo)記(參考標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1432-2014)進(jìn)行遺傳背景分析。用于靶基因選擇和背景分析的SSR標(biāo)記引物的序列來(lái)源Maizegdb網(wǎng)站(http://www.MaizEgdb.org/)，由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.5 萌發(fā)期的耐旱性鑒定

參照《玉米抗旱性鑒定技術(shù)規(guī)范》(DB 13/T 1282—2010)選取整齊一致、顆粒飽滿(mǎn)、無(wú)破損的玉米種子進(jìn)行萌發(fā)期的抗旱鑒定。每份材料選取25粒，共3次重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

理論背景回復(fù)率計(jì)算公式：E[G(g)]=1-(1/2)g+1；基于分子標(biāo)記的背景回復(fù)率計(jì)算公式：G(g)=[L+X(g)]/2L[22-23]，式中G(g)為在g代的遺傳背景回復(fù)率；g為用于回交的世代次數(shù)；L為參與分析的分子標(biāo)記數(shù)量；X(g)為回交g代中表現(xiàn)為與輪回親本相同帶型標(biāo)記的數(shù)量。用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS 23軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

利用CAPS標(biāo)記dhnC 397和SSR標(biāo)記umc1634對(duì)供試材料進(jìn)行多態(tài)性篩選。結(jié)果表明，在dhn1位點(diǎn)，PH 6 WC的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被StyI酶切，表明PH 6 WC在dhn1位點(diǎn)不具有耐旱性，而CML 538、CML 539、QR 273、和LX 9801在dhn1位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被StyI酶切，表明這些自交系在dhn1位點(diǎn)具有耐旱性。在dhn2位點(diǎn)，連鎖標(biāo)記umc 1634在CML 538、QR 273、PH 6 WC和LX 9801的擴(kuò)增產(chǎn)物均有多態(tài)，CML 539與PH 6 WC、QR 237和LX 9801的擴(kuò)增產(chǎn)物均有多態(tài)(圖1)。

2.2 靶基因選擇結(jié)果

在BC1F1/S1分離世代，于苗期利用CAPS標(biāo)記dhnC 397和SSR標(biāo)記umc 1634進(jìn)行靶基因選擇(圖2)。構(gòu)建的6個(gè)群體共586個(gè)單株，共中選了56個(gè)單株，根據(jù)田間植株表現(xiàn)，最終收獲22份株系。以PH 6 WC為輪回親本的2個(gè)群體，中選24個(gè)單株，實(shí)際收獲8株；以QR 273為輪回親本的2個(gè)群體，中選19個(gè)單株，實(shí)際收獲7株；以LX 9081為輪回親本的2個(gè)群體，中選13個(gè)單株，實(shí)際收獲7株，其中獲得滲入dhn1基因的株系共1份，編號(hào)為NH 13；同時(shí)滲入dhn1與dhn2基因的株系共2份，編號(hào)為NH 4和NH 16；其余19個(gè)株系都滲入了dhn2基因(表3)。后繼續(xù)種植收獲的22份株系自交加代直至穩(wěn)定。

注：a為CML 538；b為CML 539；1為PH 6 WC；2為QR 273；3為L(zhǎng)X 9801。圖3 部分SSR標(biāo)記在親本間多態(tài)性的篩選Fig.3 Screening of polymorphism among parents with partial SSR markers

表3 BC1F1/S1世代目標(biāo)基因選擇結(jié)果

2.3 遺傳背景分析結(jié)果

用40對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)獲得的穩(wěn)定株系進(jìn)行遺傳背景分析(表4)。結(jié)果表明，各群體收獲材料的背景回復(fù)率介于72.5%～92.5%之間，平均值為82.78%，CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC群體最高，達(dá)到84%，比理論值高9%；CML 539/PH 6 WC//PH 6 WC群體最低，為81.17%，比理論值高6.17%。在22份材料中，除了CML 538/LX 9801//LX 9801群體的NH 15，遺傳背景回復(fù)率為72.5%，低于理論背景回復(fù)率75%，其余都高于75%，最高為CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC群體的NH 4，高達(dá)92.5%；最低為CML 538/LX 9801//LX 9801群體的NH 9，低至72.5%。

表4 22份材料背景回復(fù)率簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)

2.4 中選材料的耐旱性鑒定

參考DB 13/T 1282-2010標(biāo)準(zhǔn)，在滲透壓為-0.50 MPa的PEG-6000干旱脅迫下，對(duì)22份材料進(jìn)行萌發(fā)期的耐旱性鑒定。結(jié)果表明，種子萌發(fā)生長(zhǎng)明顯受到抑制，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組種子最終萌發(fā)率存在極顯著差異(p<0.01)。22份材料的耐旱指數(shù)介于45.54%～71.07%之間，耐旱指數(shù)最高的為NH 17，高達(dá)71.07%；最低為NH 2，低至45.54%，其中，4份材料為弱耐旱型，17份材料為中等耐旱型，1份材料為強(qiáng)耐旱型(表5)。NH 4與NH 16同時(shí)滲入耐旱dhn1和dhn2基因，耐旱指數(shù)分別為61.23%和67.05%，明顯高于同一群體的其他收獲材料，說(shuō)明耐旱基因dhn1和dhn2同時(shí)滲入時(shí)，對(duì)耐旱性具有一定累加作用。

表5 22份材料萌發(fā)期的耐旱性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究以引進(jìn)的耐旱性玉米材料作為供體，與普通玉米自交系作為受體構(gòu)建了6個(gè)回交群體，利用MAS進(jìn)行靶基因選擇，將耐旱主效基因滲入普通玉米自交系中，共獲得22份材料，根據(jù)萌發(fā)期的初步抗旱鑒定，18份材料達(dá)到中等及以上耐旱性，可以為玉米抗旱育種提供材料支撐。

為提高玉米耐旱性，Ribaut等[24]使用分子標(biāo)記輔助育種，將玉米開(kāi)花吐絲間隔期較短的耐旱供體Ac 7643中5個(gè)ASL QTLs，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育滲入到優(yōu)良熱帶干旱敏感受體CML 247中，獲得了開(kāi)花吐絲間隔期較短的玉米材料。柳思思[20]利用CAPS功能標(biāo)記dhnC 397，對(duì)210份自交系進(jìn)行分子篩選，結(jié)果證明，138份材料具有抗旱性，與210份自交系基本抗旱信息一致。Liu等[25]通過(guò)對(duì)熱帶和溫帶地區(qū)的368個(gè)玉米品種候選基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找到了與玉米抗旱有關(guān)的基因ZmDREB，通過(guò)回交導(dǎo)入與分子輔助等方法，進(jìn)一步證明該基因的表達(dá)可以增強(qiáng)玉米的耐旱能力。耐旱主效基因或是調(diào)控基因?qū)δ秃档膹?qiáng)弱具有決定性作用[26]。本研究利用MAS技術(shù)，將耐旱性主效QTL(或基因)dhn1與dhn2滲入普通玉米自交系中，經(jīng)耐旱性鑒定，獲得的18份中等及以上耐旱性材料，對(duì)耐旱玉米的分子改良具有參考作用。

種子萌發(fā)期模擬干旱處理是耐旱性鑒定的常用方法。郭效龍等[27]以抗旱性較強(qiáng)的玉米自交系鄭58和不抗旱自交系E 28為試材，利用不同濃度PEG-6000水溶液在萌發(fā)期模擬干旱脅迫，結(jié)果表明，鄭58的種子萌發(fā)率、萌發(fā)耐旱指數(shù)均高于E 28。賈凱旋等[28]以河北省推廣面積較大的37個(gè)玉米品種為試驗(yàn)材料，采用滲透壓為-0.4 MPa的PEG-6000溶液在萌發(fā)期模擬干旱脅迫，通過(guò)萌發(fā)指數(shù)進(jìn)行分級(jí)，獲得強(qiáng)抗耐旱型及以上的品種10份。姚玉波等[29]以35份玉米自交系為試驗(yàn)材料，采用滲透壓為-0.4 MPa的PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，與對(duì)照組比較，種子最終萌發(fā)率存在極顯著差異，通過(guò)對(duì)萌發(fā)指數(shù)的分析，鑒定出抗旱型材料4份。本研究參考DB 13/T 1282-2010標(biāo)準(zhǔn)，在滲透壓為-0.50 MPa的PEG-6000干旱脅迫下，對(duì)中選的22份材料進(jìn)行萌發(fā)期的抗旱鑒定，與前人研究結(jié)果一致，但由于選取的處理濃度(滲透勢(shì)為-0.50 MPa)較高，因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)秃抵笖?shù)研究結(jié)果與之相比偏低，導(dǎo)致抗旱類(lèi)型劃分略有差異。玉米耐旱性是由多種數(shù)量性狀和質(zhì)量性狀復(fù)合遺傳因子組成，十分復(fù)雜，在創(chuàng)制耐旱種質(zhì)時(shí)，不但要考慮耐旱主效QTL位點(diǎn)(或基因)的分子標(biāo)記檢測(cè)的準(zhǔn)確性，還應(yīng)考慮對(duì)獲得的中選株系進(jìn)行耐旱性鑒定，二者結(jié)合起來(lái)，才能獲得更準(zhǔn)確的耐旱性種質(zhì)。