薛堯 展冠軍 馬靜

[摘要]目的：觀察康復(fù)新凝膠劑對小鼠皮膚創(chuàng)面損傷的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成模型組、康復(fù)新凝膠劑組（凝膠劑組）、林可霉素利多卡因凝膠劑組（林可霉素組），每組20只，采用全層皮膚切除法在C57BL/6J小鼠背部制備傷口，傷口造模后開始按組對應(yīng)給藥10d;于治療第3、7、10天拍照觀察傷口圖像并計(jì)算創(chuàng)面愈合率;酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）與轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的含量;于治療后第10天處死各組小鼠，蘇木精-伊紅染色法（HE）觀察創(chuàng)面組織變化;免疫組化染色檢測創(chuàng)面組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（iNOS）與M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD206）蛋白表達(dá);熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測創(chuàng)面組織中IL-6、TGF-β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與白細(xì)胞介素-10（IL-10）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與模型組比較，康復(fù)新凝膠劑組小鼠于治療后第3、7、10天傷口愈合較為明顯，創(chuàng)面愈合率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;血清中IL-6含量顯著下降且TGF-β含量顯著升高（P<0.05）。治療10d后，與模型組比較，康復(fù)新凝膠劑組小鼠創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤明顯，新生致密肉芽組織，有大量新生毛細(xì)血管形成，同時VEGF陽性表達(dá)率顯著增加（P<0.05），IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），IL-10、TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），iNOS陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少而CD206陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P<0.05），且與林可霉素利多卡因凝膠劑作用等效。結(jié)論：康復(fù)新凝膠劑能夠促進(jìn)小鼠傷口愈合，減輕傷口部位炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與創(chuàng)面巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]創(chuàng)面損傷;康復(fù)新凝膠劑;林可霉素利多卡因凝膠劑;巨噬細(xì)胞;炎癥反應(yīng)

[中圖分類號]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）04-0110-05

Study on the Effect and Related Mechanism of Kangfuxin Gel on the Repair of Mice Wound Tissue

XUE Yao，ZHAN Guan-jun，MA Jing

[Department of Pharmacy，Nanjing Dachang Hospital（Jiangbei Campus of Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University），Nanjing 210048，Jiangsu，China]

Abstract： Objective? To observe the effect of Kangfuxin Gel on skin wounds in mice and explore its possible mechanism. Methods? 60 C57BL/6J mice were randomly divided into the model group， the Kangfuxin gel group （gel group） and the lincomycin lindocaine gel group （lincomycin group）， 20 mice in each group. Used full-thickness skin excision method to prepare wounds on the back of C57BL/6J mice. After wound modeling， start to administer drugs according to the group for 10 days. Taked pictures and observe wound images on the 3， 7 and 10 days of treatment and calculate the wound healing rate. Detectted the levels of interleukin-6 （IL-6） and transforming growth factor-β （TGF-β） in the blood by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mice of each group were sacrificed on the 10th day after treatment. Hematoxylin-Eosin staining method （HE） observes the changes of wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， M1 macrophage marker （iNOS） and M2 macrophage marker （CD206） in wound tissue. Fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA expression levels of IL-6， TGF-β， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissues. Results? Compared with the model group， mice in the Kangfuxin gel group had more obvious wound healing on the 3， 7 and 10 days after treatment， the wound healing rate increased significantly， the differences were statistically significant （P<0.05）. The serum IL-6 content decreased significantly and the content of TGF-β increased significantly （P<0.05）. After 10 days of treatment， compared with the model group， the inflammatory cell infiltration in the wound surface of the Kangfuxin gel group was obvious， new dense granulation tissue， a large number of new capillaries were formed， and the VEGF positive expression rate was significantly increased （P<0.05）， IL-6 and TNF-α mRNA expression levels decreased significantly （P<0.05）， IL-10 and TGF-β mRNA expression levels increased significantly （P<0.05）， the number of iNOS positive cells decreased significantly while the number of CD206 positive cells increased significantly （P<0.05）， and was equivalent to lincomycin and lindocaine gel. Conclusion? Kangfuxin gel can promote wound healing in mice and reduce the inflammatory response at the wound site. The mechanism may be related to the phenotypic transformation of macrophages on the wound surface.

Key words： wound injury; Kangfuxin gel; Lincomycin lidocaine gels; macrophage; inflammatory reaction

皮膚持續(xù)暴露于外部極易受到各種創(chuàng)傷，皮膚受傷后會觸發(fā)一系列復(fù)雜生理病理過程來進(jìn)行創(chuàng)面愈合，主要涉及以下四個階段：凝血，炎癥，遷移-增殖和重塑，任何一個階段功能出現(xiàn)障礙都會導(dǎo)致傷口愈合受阻[1-3]。創(chuàng)面若不能有效、快速愈合，則會導(dǎo)致繼發(fā)感染甚至引發(fā)死亡[4]，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量與健康，探究加速創(chuàng)面愈合并改善愈合質(zhì)量的新策略對于患者來說至關(guān)重要。巨噬細(xì)胞是源于血液系統(tǒng)中的單核細(xì)胞，也是先天性免疫的重要組成部分。研究表明，巨噬細(xì)胞及其分泌的相關(guān)因子在創(chuàng)面愈合的所有階段均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5-7]。巨噬細(xì)胞活化后可被分為兩種不同的表型，即M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。研究表明，在創(chuàng)面的炎癥發(fā)生發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化直接影響著創(chuàng)面愈合的速度與質(zhì)量[8]?？祻?fù)新凝膠劑是由大蟾干燥蟲體的乙醇提取物制成的外用制劑，其液體制劑具有激活創(chuàng)面免疫活性細(xì)胞、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)以及快速促進(jìn)傷面愈合的作用[9]。本研究旨在觀察康復(fù)新凝膠劑對小鼠皮膚創(chuàng)面的促愈合作用，通過對傷口部位進(jìn)行組織學(xué)及分子生物學(xué)分析，探討康復(fù)新凝膠劑促創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑：清潔級C57BL/6J雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（22±3）g，購自東南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。康復(fù)新凝膠劑參考羅誠等的方法[10]進(jìn)行制備，林可霉素利多卡因凝膠劑（批號：160601）購自上海新亞藥業(yè)閔行有限公司，ELISA試劑盒、HE染色試劑購自上海碧云天生物研究所，免疫組化染色試劑購自北京中杉金橋公司，Trizol 試劑、Prime ScriptTM RT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒購自日本Takara公司，大鼠單克隆抗VEGF、兔單克隆抗 iNOS與兔單克隆抗CD206購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購自武漢谷歌生物科技有限公司，其他試劑均用國產(chǎn)分析純。

1.2 動物造模：C57BL/6J小鼠通過腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/100g）麻醉后，進(jìn)行消毒處理，在小鼠背面脊梁兩側(cè)用無菌手術(shù)刀切直徑1.6cm大小的全層皮膚創(chuàng)面，深度達(dá)皮下深筋膜，切割后，無菌紗布壓迫止血，用凡士林油紗布覆蓋傷口，防止創(chuàng)面干燥，并使用醫(yī)用膠布固定。將小鼠獨(dú)籠飼養(yǎng)，期間自由飲水與進(jìn)食。2d后小鼠出現(xiàn)精神萎靡，且背部創(chuàng)面有膿性分泌物，則表示造模成功。

1.3 動物分組與處理：將60只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成3組，分別為模型組、康復(fù)新凝膠劑組（凝膠劑組）、林可霉素利多卡因凝膠劑組（林可霉素組），每組20只。各組小鼠進(jìn)行造模，造模成功后，生理鹽水擦洗小鼠創(chuàng)面，凝膠劑組和林可霉素組小鼠創(chuàng)面分別予以0.1ml康復(fù)新凝膠劑、林可霉素利多卡因凝膠劑處理，模型小鼠創(chuàng)面貼敷生理鹽水。每天換藥1次，直至處死。

1.4 創(chuàng)面愈合率測定：分別于治療后第3、7、10天檢測各組小鼠創(chuàng)面愈合情況，對小鼠的創(chuàng)面進(jìn)行拍照，用Image-ProPlus軟件進(jìn)行測定分析，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（原始創(chuàng)面總面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原創(chuàng)面總面積×100%。

1.5 ELISA檢測血清中IL-6與TGF-β的含量：分別于治療后第3、7、10天各組小鼠心臟取血，血液在室溫下靜置30min，通過冷凍離心機(jī)中以3 500r/min離心15min，吸取上清。按小鼠IL-6與TGF-β ELISA試劑盒說明書操作步驟，于酶標(biāo)儀450nm處測定OD值，計(jì)算IL-6與TGF-β含量。

1.6 組織學(xué)觀察：于治療后第10天處死各組小鼠，以創(chuàng)面為中心，距創(chuàng)面邊緣向外2mm切取組織。將組織分成兩半，一半放置于液氮后保存于-80℃，另一半以4%多聚甲醛固定，用于病理標(biāo)本制作。創(chuàng)面組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4μm的切片，常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行HE染色：蘇木精染色5min，流水沖洗后，伊紅染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，自然風(fēng)干，中性樹膠封片，于光鏡下觀察組織中炎性細(xì)胞浸潤、新生毛細(xì)血管量、肉芽組織生成情況。

1.7 免疫組化檢測創(chuàng)面組織VEGF、iNOS與CD206表達(dá)：于治療后第10天檢測各組小鼠創(chuàng)面組織VEGF、iNOS與CD206的蛋白表達(dá)情況。創(chuàng)面組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片后，進(jìn)行常規(guī)脫蠟水化。放入抗原修復(fù)液中高溫下進(jìn)行修復(fù)，室溫自然冷卻后PBS沖洗，并滴加3% H2O2作用20min，PBS再次洗滌后，滴加稀釋的大鼠單克隆抗VEGF（1：100）、兔單克隆抗iNOS（1：80）、兔單克隆抗CD206（1：200）為一抗，4℃下孵育過夜，次日PBS洗滌后，滴加對應(yīng)的二抗工作液，在室溫孵育60min后，PBS沖洗，滴加DAB顯色3min，經(jīng)蘇木素復(fù)染2min，梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集照片。

1.8 qRT-PCR檢測創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、IL-10與TGF-β mRNA表達(dá)：根據(jù)RNA提取試劑盒提取創(chuàng)面組織總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β mRNA的表達(dá)情況，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進(jìn)行操作，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)條件為95℃ 30s（1個循環(huán)），95℃ 5s、60℃ 30s（40個循環(huán)）。采用2-ΔΔCt法來計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量。使用的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算所得數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA進(jìn)行，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 康復(fù)新凝膠劑對創(chuàng)面愈合率的作用：分別于治療后第3、7、10天檢測各組小鼠創(chuàng)面愈合情況，結(jié)果如圖1、表2所示，第3天各組小鼠傷口開始愈合，林可霉素組和凝膠劑組小鼠的創(chuàng)面愈合率顯著高于模型組小鼠創(chuàng)面愈合率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。給藥第7天，各組小鼠傷口均變小，與模型組比較，林可霉素組和凝膠劑組小鼠的創(chuàng)面愈合率顯著增加（P<0.05）。第10天各組小鼠創(chuàng)面愈合情況更明顯，林可霉素組和凝膠劑組創(chuàng)面基本愈合，模型組仍有痂皮，林可霉素組和凝膠劑組創(chuàng)面愈合率與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 各組小鼠血清中IL-6與TGF-β含量比較：各組小鼠血清中IL-6與TGF-β含量檢測結(jié)果如表3所示，第3、7、10天林可霉素組和凝膠劑組小鼠血清中IL-6含量較模型組小鼠顯著下降，同時TGF-β含量較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各組小鼠創(chuàng)面組織觀察：HE染色結(jié)果顯示，損傷后第10天，模型組創(chuàng)面炎性細(xì)胞稀疏，肉芽組織形成較少，新生毛細(xì)血管量少;與模型組比較，林可霉素組和凝膠劑組創(chuàng)面表皮增厚，炎性細(xì)胞浸潤明顯，新生致密肉芽組織，有大量新生毛細(xì)血管形成。

2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織VEGF表達(dá)比較：VEGF表達(dá)結(jié)果如圖4所示，模型組VEGF陽性細(xì)胞著色較淺，林可霉素組和凝膠劑組VEGF陽性細(xì)胞著色較深且分布廣，林可霉素組和凝膠劑組VEGF陽性表達(dá)率分別為（25.73±4.15）%、（29.48±4.14）%，較模型組VEGF陽性表達(dá)率[（8.41±1.62）%]顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織M1型和M2型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)比較：qRT-PCR檢測結(jié)果如表4所示，損傷第10天，林可霉素組和凝膠劑組IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平較模型組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而IL-10與TGF-β mRNA表達(dá)水平顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.6 各組小鼠創(chuàng)面組織iNOS與CD206表達(dá)：免疫組化染色結(jié)果如圖5～6所示，林可霉素組和凝膠劑組iNOS陽性細(xì)胞分布稀疏、著色較淺，模型組iNOS陽性細(xì)胞分布較廣泛，著色較深，林可霉素組和凝膠劑組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組iNOS陽性細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;模型組CD206陽性細(xì)胞的分布較為稀疏，林可霉素組和凝膠劑組CD206陽性細(xì)胞著色深且分布范圍廣，林可霉素組和凝膠劑組CD206陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于模型組CD206陽性細(xì)胞數(shù)（P<0.05）

3? 討論

目前，各類因素導(dǎo)致的外傷性創(chuàng)面損傷的發(fā)生率越來越高。在創(chuàng)面愈合過程中，各級反應(yīng)錯綜復(fù)雜而又相互協(xié)同，炎癥反應(yīng)作為創(chuàng)面修復(fù)的第一階段，在組織受損后開始，過程涉及凝血級聯(lián)反應(yīng)、炎癥途徑和免疫系統(tǒng)相關(guān)反應(yīng)[3]。修復(fù)的第二階段發(fā)生在創(chuàng)傷后2～10d內(nèi)，其特征是不同類型的細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移以及血管的生成，該過程主要受血管內(nèi)皮生長因子A和成纖維細(xì)胞生長因子2的調(diào)節(jié)[11]。毛細(xì)血管的擴(kuò)散為成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞帶來營養(yǎng)和氧合作用，通過肉芽組織代替纖維蛋白基質(zhì)，并形成角質(zhì)成為細(xì)胞遷移的底物，直到恢復(fù)上皮屏障為止[12]。修復(fù)的第三階段為重塑過程，通常在損傷后2～3周內(nèi)開始，可以持續(xù)1年以上，在此階段，大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡期，導(dǎo)致纖維化腫塊[13]，其特征為膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的活力降低。

創(chuàng)面愈合率是評估創(chuàng)面愈合情況最直觀的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，康復(fù)新凝膠劑作用下小鼠創(chuàng)面愈合率得以提高。肉芽組織由成纖維細(xì)胞和新生的毛細(xì)血管組合構(gòu)成，在組織損傷修復(fù)過程中可填充于傷口部位，通過抵抗感染與包裹炎性滲出物來保護(hù)創(chuàng)面，從而在傷口愈合向組織重塑的過渡提供了有利條件[14]。本研究通過創(chuàng)面組織病理染色，觀察到在康復(fù)新凝膠劑治療下，小鼠創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤明顯，有大量新生毛細(xì)血管形成，肉芽組織致密較厚，由此說明康復(fù)新凝膠劑促進(jìn)了小鼠的創(chuàng)面修復(fù)。

巨噬細(xì)胞的特征在于其可塑性高，根據(jù)情況表現(xiàn)出不同的表型和功能。M1巨噬細(xì)胞具有促炎作用，可分泌促炎因子如IL-6、TNF-α，能夠促進(jìn)T輔助細(xì)胞1（Th1）應(yīng)答并具有抑制腫瘤活性的作用[15]。M2巨噬細(xì)胞有助于組織修復(fù)，分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β以及生長因子VEGF等[16]。巨噬細(xì)胞向表型M1或M2的極化是一個動態(tài)且可逆的過程，在不同生理病理?xiàng)l件下會發(fā)生變化。在皮膚傷口愈合的階段，傷口部位炎癥反應(yīng)過度，導(dǎo)致大量M1型巨噬細(xì)胞持續(xù)存在于傷口部位，并難以轉(zhuǎn)化為能夠促進(jìn)愈合的M2型巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致瘡面修復(fù)困難[17-19]。在本研究中，在康復(fù)新凝膠劑作用下，qRT-PCR結(jié)果顯示小鼠創(chuàng)面組織中IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平降低，而IL-10與TGF-βmRNA表達(dá)水平升高。此外，免疫組化染色同樣顯示，iNOS陽性細(xì)胞數(shù)減少且CD206陽性細(xì)胞數(shù)增加，VEGF陽性表達(dá)率升高。這些結(jié)果均表明，康復(fù)新凝膠劑作用于創(chuàng)面后可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，同時抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化，從而改善創(chuàng)面部位巨噬細(xì)胞表型異常的現(xiàn)象。

綜上所述，康復(fù)新凝膠劑可促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合，有利于創(chuàng)面肉芽組織與新生毛細(xì)血管的形成，其機(jī)制可能與促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。結(jié)合當(dāng)前創(chuàng)面愈合困難的現(xiàn)狀，研發(fā)外用的愈合劑具有實(shí)用價值，本研究可為皮膚創(chuàng)面治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但目前康復(fù)新凝膠劑相關(guān)研究報道較少，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制仍需進(jìn)一步的深入研究，以期應(yīng)用于臨床治療。

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[收稿日期]2020-06-22

本文引用格式：薛堯，展冠軍，馬靜.康復(fù)新凝膠劑對小鼠創(chuàng)面組織修復(fù)的作用及相關(guān)機(jī)制探討[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（4）：110-114.