劉丹 尚春明 楊進 張仙保 潘子旺 劉燕 鄭于莉

摘要 以根結(jié)線蟲病樣、番茄品種及組合為試材，采集包頭市根結(jié)線蟲暴發(fā)地一個根結(jié)線蟲病樣，進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定;利用PCR技術(shù)對24個番茄品種及組合進行Mi-1基因擴增篩選。結(jié)果表明，感染內(nèi)蒙古包頭市番茄的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲;篩選出3個純合抗根結(jié)線蟲番茄組合?？垢衅贩N及組合均產(chǎn)生750 bp的特異片段，純合抗病基因的番茄組合存在TaqⅠ酶切位點，酶切后產(chǎn)生了570和160 bp特異性片段，為防治當(dāng)?shù)胤迅Y(jié)線蟲及培育抗病品種積累材料。

關(guān)鍵詞 番茄;根結(jié)線蟲;分子生物學(xué)

中圖分類號 S-433.1? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）12-0148-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.037

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Pathogen Identification and Resistant Material Screening of Tomato Root knot Nematode in Protected Field

LIU Dan1， SHANG Chun ming1， YANG? Jin2 et al

（1.Baotou Institute of Agricultural Science， Baotou， Inner Mongolia 014013; 2. Inner Mongolia Agricultural University， Baotou， Inner Mongolia? 014013）

Abstract Taking the root knot nematode samples and tomato varieties and combinations as test materials， a root knot nematode disease sample from the root knot nematode outbreak area in Baotou City was collected for morphological and molecular biological identification. The Mi 1 gene amplification and screening of 24 tomato varieties and combinations were carried out by PCR technology. The results showed that the root knot nematode infected tomato in Baotou City of Inner Mongolia was the southern root knot line， three homozygous tomato combinations with resistance to root knot nematode were screened out. The resistant varieties and combinations all produced 750 bp specific fragments. The Taq I restriction site existed in the homozygous resistant tomato combinations， and 570 and 160 bp specific fragments were produced after enzyme digestion， which were used to accumulate materials for the control of local tomato root knot nematode and the cultivation of disease resistant varieties

Key words Tomato;Root knot nematode;Molecular biology

根結(jié)線蟲是一類在農(nóng)作物上危害極大的植物寄生性線蟲。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界各地農(nóng)作物因根結(jié)線蟲危害，平均每年可使農(nóng)業(yè)減產(chǎn)24.5%，造成經(jīng)濟損失在1 000億美元以上[1]。目前，報道近百種根結(jié)線蟲有效種，能夠寄生的植物達3 000多種，其中最常見造成危害最嚴重的線蟲有南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲[2]。

近年來，隨著種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，保護地蔬菜復(fù)種指數(shù)越來越高，致使根結(jié)線蟲病危害日趨嚴重，造成蔬菜大幅減產(chǎn)[3]。保護地番茄栽培面積相對較大，抗根結(jié)線蟲病的番茄品種相對缺乏，已成為生產(chǎn)上急需解決的問題[4]。內(nèi)蒙古自治區(qū)隨著蔬菜供應(yīng)量不斷增加，根結(jié)線蟲也迅速發(fā)展和蔓延[5]。根結(jié)線蟲已成為一類嚴重危害番茄且具有廣泛寄主的植物寄生線蟲。利用抗線蟲品種，是最為經(jīng)濟、有效、安全的根結(jié)線蟲防控途徑。目前已知的番茄抗根結(jié)線蟲病的主要基因是Mi基因家族，該家族包含9個抗性基因，分別為 Mi-1、Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-7、Mi-8、Mi-9，其中 Mi-1、Mi-3、Mi-7、Mi-8 表現(xiàn)為不耐高溫;Mi-2、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9 表現(xiàn)為耐高溫[6]。目前Mi-1 基因是唯一一個被商業(yè)化利用的基因，可抗3種線蟲，在栽培番茄中具有很高的應(yīng)用價值[7]。 根結(jié)線蟲的防治主要有物理防治、化學(xué)防治、生物防治以及種植抗性品種等策略[8-9]?？剐曰驗榉芽垢Y(jié)線蟲的育種提供了豐富的遺傳資源，篩選抗根結(jié)線蟲病的番茄品種顯得尤為重要。近十幾年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為根結(jié)線蟲的準(zhǔn)確鑒定及抗病材料的篩選提供了重要手段。戴均濤等[10]利用 SCAR快速鑒定檢測番茄Mi基因的有無。吳媛媛等[11]利用與番茄根結(jié)線蟲病抗病基因 Mi 緊密聯(lián)鎖的 CAPS 標(biāo)記進行抗病材料的檢測，證明所篩選的材料屬于單基因控制的質(zhì)量性狀遺傳位點。王孝宣等[12]利用Mutiplex-CAPS技術(shù)同時檢測番茄抗根結(jié)線蟲基因（Mi）和抗葉霉病基因（Cf5）。韓娜等[13]采用酶切擴增多態(tài)性序列方法對國內(nèi)市場上的26個番茄品種進行Mi檢測，篩選出含有純合Mi基因的品種。防治番茄根結(jié)線蟲危害的理想途徑是培育和利用抗蟲番茄品種。通過PCR技術(shù)，能夠快速檢測番茄材料是否含有Mi基因，有助于篩選抗蟲材料，加快抗蟲番茄育種。

筆者采集內(nèi)蒙古包頭市根結(jié)線蟲主要暴發(fā)地的番茄根結(jié)線蟲病樣，通過形態(tài)鑒別法結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)進行根結(jié)線蟲種類鑒定及抗病品種及組合的篩選，旨在明確該地區(qū)番茄根結(jié)線蟲的種類并篩選抗病品種及組合，為當(dāng)?shù)胤迅Y(jié)線蟲病的有效防治提供理論依據(jù)及培育番茄抗根結(jié)線蟲新品種積累材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

受根結(jié)線蟲感染的番茄根部組織，采自內(nèi)蒙古包頭市農(nóng)大職業(yè)技術(shù)學(xué)校大棚，在發(fā)病地塊，隨機取20株番茄根系，所采樣品統(tǒng)一保存于4 ℃冰箱，供試的大部分番茄品種及組合為包頭市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院自行選育。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 。

將發(fā)病的番茄根系清洗干凈，分離被侵染的番茄根組織中的雌蟲，分離出單頭雌蟲，制作會陰花紋并觀察，參照張靠穩(wěn)等[14]、馮志新[15]的方法稍作修改。挑取雌成蟲放入滴有一滴1%肥皂水的載玻片上，用解剖刀從蟲體后部約1/3處輕輕切下，再將其后部雜物用針尖輕輕清除干凈，使其切口向下，將后部展開，做成臨時裝片，在顯微鏡下觀察其會陰花紋，進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 病原線蟲基因組提取。

病原線蟲DNA提取，參照思彬彬等[16]的方法并稍作修改，取6 μL DNA樣品于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離，以檢測DNA的濃度。

1.2.3 特異性引物。

通用引物M18s/M28s參照馮光泉等[17]設(shè)計，南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲特異性引物參照張鋒等[18]設(shè)計。番茄Mi-1基因引物設(shè)計參照李君明等[19]設(shè)計（表1）。

1.2.4 PCR擴增及酶切體系。

（1）引物M18s/M28s對供試線蟲ITS的PCR擴增。引物M18s/M28s的PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。

（2）引物MI-F/MI-R對南方根結(jié)線蟲的特異性PCR擴

增。擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果并拍照。

（3）番茄抗病材料Mi-1基因的PCR擴增體系及酶切體系。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括 24 μL 10×PCR bufferr（0.1 U/μL Taq DNA Polymerase，3 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs），上下游引物各1 μL，1 μL DNA模板，最后加無菌雙蒸水至50 μL。擴增條件參照李君明等[19]的方法。

酶切體系為PCR擴增產(chǎn)物10.0 μL加入 10 U 的 Taq I 酶0.5 μL，Buffer 1.5 μL，終體積加超純水至 25.0 μL，65 ℃ 保溫1 h。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物于2.0% 瓊脂糖凝膠在電壓80～100 V 條件下電泳45 min，以100 bp DNA Marker 為標(biāo)準(zhǔn)分子量，用凝膠成像儀觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 會陰花紋形態(tài)學(xué)觀察

從番茄根部挑取根結(jié)線蟲，再隨機挑取20頭雌成蟲逐一進行形態(tài)特征觀察，通過形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)，雌成蟲會陰花紋背弓高，近方形，頂部平，平滑略呈波浪形，無明顯側(cè)線，線紋在側(cè)區(qū)處有間斷和分岔。對照文獻資料[1]，觀察到的這些特征與南方根結(jié)線蟲雌成蟲的特征一致，初步確認導(dǎo)致包頭市郊區(qū)保護地番茄根結(jié)線蟲病發(fā)生的病原為南方根結(jié)線蟲（圖1、2）。

2.2 引物MI-F/MI-R對南方根結(jié)線蟲的特異性PCR擴增

參照馮光泉等[17]方法提取根結(jié)線蟲DNA。利用線蟲通用引物M18s/M28s對供試線蟲ITS的PCR擴增結(jié)果表明，擴增到長度為544 bp的片段，片段之間沒有多態(tài)性，表明提取各采樣點的線蟲DNA均成功，可用于后續(xù)分析（圖3）。利用特異性引物對根結(jié)線蟲DNA進行PCR擴增，由圖4可知，南方根結(jié)線蟲特異性引物的擴增呈陽性，得到一條大小約900 bp堿基對的擴增片段;其他3個特異性引物未擴增出條帶。將PCR產(chǎn)物直接送測序公司測序，在基因庫中將該序列與已知南方根結(jié)線蟲序列進行BLAST同源性分析（Accesion no.MN444135.1），相似性達99.69%，由此確定包頭市郊區(qū)保護地番茄根結(jié)線蟲的病原為南方根結(jié)線蟲。

2.3 番茄抗性材料Mi-1基因檢測

由圖5A和5B可知，利用番茄抗根結(jié)線蟲特異性引物SCAR F/SCAR R對供試的424份番茄品種及組合進行Mi-1基因PCR擴增與檢測，無論抗感品種及組合均能檢測出一條750 bp特異性片段;PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ酶切后，抗病純合基因型存在酶切位點，其中編號5、6、7的6份番茄組合均產(chǎn)生了570和160 bp 2條特異性片段，為純合顯性Mi-1/Mi-1抗病材料，產(chǎn)生了570和160 bp 2條特異性片段，其余編號的PCR產(chǎn)物不能被TaqⅠ酶消解，即不含顯性Mi-1基因，其基因型為純合隱性基因mi-1/mi-1（表2）。

3 結(jié)論與討論

根結(jié)線蟲病是危害國內(nèi)外番茄生產(chǎn)的重要病害，對根結(jié)線蟲種類進行準(zhǔn)確的鑒定和檢測成為防治該病的前提條件，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，運用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法并結(jié)合PCR技術(shù)，能夠快速準(zhǔn)確地鑒定根結(jié)線蟲種類，且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠[20]。通過采集番茄發(fā)病根部組織的根結(jié)線蟲樣本，制作根結(jié)線蟲會陰花紋，從番茄根部組織分離的線蟲經(jīng)ITS擴增，南方根結(jié)線蟲特異性引物MI-F/MI-R對根結(jié)線蟲DNA進行PCR擴增、凝膠回收、測序及BLAST比對，此結(jié)果表明侵染內(nèi)蒙古包頭市郊區(qū)保護地番茄的主要根結(jié)線蟲屬于南方根結(jié)線蟲。在此次鑒定中，未發(fā)現(xiàn)其他根結(jié)線蟲合并侵染的情況，目前發(fā)現(xiàn)包頭市郊區(qū)只有東河沙爾沁發(fā)生根結(jié)線蟲，導(dǎo)致采集的樣本不豐富，在以后的工作中需要不斷定時監(jiān)測及做好防治工作。

根結(jié)線蟲已成為內(nèi)蒙古赤峰市保護地主要病害，對番茄造成嚴重的產(chǎn)量損失，包頭市郊區(qū)番茄根結(jié)線蟲已成為逐漸發(fā)展態(tài)勢，選育抗線蟲品種是解決這一難題的根本途徑。該研究通過對24份番茄品種及組合進行Mi-1基因分子檢測，共篩選出3份純合抗病組合。3份純合抗病組合含570、160 bp 2條特異性片段，其余21份材料只含750 bp片段。這些材料中是否還含有其他Mi家族的基因還需進一步研究，同時在篩選材料的同時，發(fā)現(xiàn)有些材料沒有Mi-1基因，其基因型尚未可知。篩選出的純合番茄抗病組合為番茄抗根結(jié)線蟲育種親本的選擇提供抗性資源信息，將加快抗病品種的選育。

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