郭宇航，辛 華，黃昕明，王 勇

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯154004)

近年來，肺炎克雷伯菌為臨床主要檢出的革蘭陰性桿菌，可引起多種細(xì)菌感染。碳青霉烯類藥物作為臨床治療革蘭陰性致病菌感染的最后一道防線，廣泛應(yīng)用于臨床治療。特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來了一定的阻礙。尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房的患者中檢出率更高，同時(shí)由于該病房的患者年齡大、基礎(chǔ)疾病多、機(jī)體免疫力低下等原因，使得CRKP的患者發(fā)病率和死亡率都很高。然而，越來越多的碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)被檢出，且呈上升趨勢。本研究旨在分析CRKP耐藥菌株的耐藥情況和分子流行病學(xué)特點(diǎn)，為我院的感控工作提供一定的數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也可以很大程度上減少耐藥菌的院內(nèi)傳播。

1 材料與方法

1.1 菌種鑒定與藥敏

對佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2016～2018年非重復(fù)CRKP進(jìn)行收集，通過VITEK 2 Compact進(jìn)行藥敏鑒定，耐藥菌株K-B法復(fù)核。

1.2 儀器與試劑

藥敏紙片購自英國Oxoid公司，PCR擴(kuò)增儀為美國Bio-Rad公司，凝膠成像系統(tǒng)為上海領(lǐng)城生物科技公司。

1.3 表型鑒定

碳青霉烯滅活試驗(yàn)鑒定菌種表型。依據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，挑取1μL滿環(huán)待檢菌株于肉湯，混勻加入美羅培南紙片，確認(rèn)紙片完全浸沒肉湯，溫箱孵育4h。挑取ATCC25922單個(gè)菌落配制0.5麥?zhǔn)蠞岫?，涂布MH平板，將孵育后紙片取出貼入MH平板，過夜培養(yǎng)。

1.4 PCR擴(kuò)增

煮沸法提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增KPC、NDM及OXA-48耐藥基因，引物如下(上海生工合成)(表1)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及成像系統(tǒng)觀察后測序比對(哈爾濱博仕生物公司)。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 鑒定及藥敏

共收集31株符合條件樣本，菌株對亞胺培南、美羅培南及哌拉西林/他唑巴坦耐藥率較高，對左氧氟沙星耐藥率較低，31株CRKP全部對阿米卡星敏感，見表2。

表2 耐藥分析

2.2 表型鑒定結(jié)果

表型檢測陽性結(jié)果為美羅培南抑菌圈直徑6～15mm或直徑16～18mm但抑菌圈內(nèi)存在散在菌落。經(jīng)檢測，31株CRKP中有30株產(chǎn)碳青霉烯酶。

2.3 耐藥基因檢測

30株CRKP全部攜帶KPC-2型碳青霉烯酶基因，1株攜帶NDM型，未檢出OXA-48型。

2.4 CRKP的標(biāo)本來源

一共收集31株CRKP菌株，主要分離自痰液標(biāo)本、支氣管沖洗液等標(biāo)本，見圖1。來源中可以看出CRKP主要分布在下呼吸道標(biāo)本。

圖1 菌株的標(biāo)本來源

2.5 實(shí)驗(yàn)菌株的臨床科室分布

31株CRKP菌株主要分離自ICU病房，其次是神經(jīng)內(nèi)科，呼吸科等，見表3。

表3 CRKP的科室分布

3 討論

CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，醫(yī)院感染細(xì)菌以革蘭陰性桿菌為主70.8%，以肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌以及銅綠假單胞菌為主，其中碳青霉烯耐藥菌株檢出率呈快速上升趨勢[1]。碳青霉烯類抗生素以其有效的殺菌功效、廣譜的抗菌特點(diǎn)作為臨床治療革蘭陰性桿菌感染的重要等級(jí)藥物，大量不合理的使用針對性地導(dǎo)致耐藥菌株不斷檢出。革蘭陰性桿菌可以“多途徑—快傳播”獲得碳青霉烯耐藥，細(xì)菌基因發(fā)生替換、插入及缺失等方式改變自身結(jié)構(gòu)以適應(yīng)抗菌藥物并介導(dǎo)耐藥的垂直傳播[2～4]。眾所周知，CRKP的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生KPC-2型碳青霉烯酶，這種類型的碳青霉烯酶在中國大陸是最常見的類型，我的研究結(jié)果也十分符合這個(gè)特點(diǎn)，KPC-2型碳青霉烯酶的檢出率也挺高。臨床治療也隨著細(xì)菌耐藥機(jī)制的變化也有所不同[5]。目前為止，blaKPC已經(jīng)在中國的許多地區(qū)被報(bào)道，包括北京，浙江，臺(tái)灣和四川[6～9]。除此之外，金屬酶，包括IMP和NDM也會(huì)導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌的碳青霉烯抗菌藥物的耐藥，尤其是NDM-1，已經(jīng)在全球范圍內(nèi)被檢出，給耐藥菌的治療帶來了威脅。BlaNDM-1首次被報(bào)道是來自一個(gè)瑞典患者的肺炎克雷伯菌株[10]。BlaNDM-1的快速廣泛傳播主要是由于質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播。

本研究針對性分析了CRKP的耐藥情況，結(jié)果表明，CRKP對左氧氟沙星以及阿米卡星耐藥率較低，對復(fù)合抑制劑及碳青霉烯類藥物耐藥率較高[11]。CRKP主要的耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶，CLSI建議采用mCIM初步鑒定是否產(chǎn)酶，研究結(jié)果顯示31株CRKP中有30株產(chǎn)碳青霉烯酶，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證31株CRKP產(chǎn)KPC-2型97%及NDM型酶3%。mCIM表型檢測方法條件簡便、易于操作且與PCR擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果大致相符[12]。此外，mCIM結(jié)合eCIM還可以用于金屬酶的檢測，2018年CLSI標(biāo)準(zhǔn)建議采用eCIM篩選金屬酶。KPC陽性的肺炎克雷伯菌在我國廣泛流行，1996年首次分離到KPC型菌株，隨后其迅速傳播并在全世界相繼被發(fā)現(xiàn)，2014年攜帶KPC-2型腸桿菌科細(xì)菌于土耳其一家醫(yī)院發(fā)現(xiàn)[13]。CRKP可引起多部位、多病種細(xì)菌感染，其可用抗生素受限，通常預(yù)后不良。相關(guān)研究表明CRKP危險(xiǎn)因素眾多并且可造成較高的病死率[14,15]。對于重癥監(jiān)護(hù)病房的患者來說，CRKP的定植是隨后發(fā)生感染的最主要的危險(xiǎn)因素，所以對于耐藥菌定植的主動(dòng)篩查是非常有用的預(yù)防措施，我們通常對于住院患者采集糞便或直腸拭子，然后進(jìn)行耐藥菌的篩查，從而根據(jù)耐藥情況采取一定的預(yù)防措施，這樣可以有效地防止耐藥菌的進(jìn)一步播散。除此之外，經(jīng)常使用抗菌藥物、ICU住院時(shí)間長、血液透析等也成為了CRKP定植的危險(xiǎn)因素。我們還需要對醫(yī)護(hù)人員，特別是ICU的醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行定期主動(dòng)篩查，因?yàn)槟退幘梢酝ㄟ^醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行播散，同時(shí)加強(qiáng)醫(yī)院環(huán)境的定期消毒也十分重要，總之耐藥菌的傳播有許多不同的途徑，我相信只要我們把每一步預(yù)防措施都盡力做好，耐藥菌的傳播也會(huì)得到遏制。對于CRKP分布在下呼吸道標(biāo)本居多，可能和臨床細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本多以留取下呼吸道標(biāo)本有關(guān)。在各標(biāo)本來源中所占比例還需結(jié)合更多的研究數(shù)據(jù)分析。本院CRKP主要為KPC-2型，表型鑒定結(jié)合mCIM可以有效檢測碳青霉烯酶。CRKP耐藥流行情況嚴(yán)重，臨床應(yīng)加強(qiáng)感控措施，合理使用抗菌藥物。然而，我們非常需要建立一個(gè)完整的耐藥細(xì)菌監(jiān)測系統(tǒng)，可以及時(shí)地發(fā)現(xiàn)耐藥菌并且積極地采取預(yù)防和治療措施，這樣可以很好地預(yù)防耐藥細(xì)菌的播散。此外，菌株同源性及耐藥傳播還有待進(jìn)一步研究。