楊成蘭，武雄雄，祁存英，李欣音，張倩倩，段瑞君*

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青稞(HordeumvulgareL.var.nudum.)占青藏高原作物種植面積的43%，在青藏高原農(nóng)作物中具有重要地位[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，青稞成為了藏區(qū)草料、釀酒等農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)的重要材料[2]。

植物原生質(zhì)體被認(rèn)為是研究基礎(chǔ)生命科學(xué)及作物育種改良的理想試驗(yàn)材料[3]。植物原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、亞細(xì)胞定位等試驗(yàn)[4]。原生質(zhì)體的分離和純化對(duì)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系起決定性的作用，近年來，有關(guān)玉米[5]、苜蓿[6]、小麥[7]等原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)染的研究已較為成熟，但對(duì)于青稞原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)染的研究較少。

酶解法是植物原生質(zhì)體分離時(shí)常用的方法之一。酶解法影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因素很多，其中甘露醇濃度、酶解時(shí)間和離心速度是比較重要的因素。因此，本研究選用青稞幼葉作為研究對(duì)象，通過對(duì)其原生質(zhì)體制備過程中各影響因素的調(diào)整，分析甘露醇濃度、酶解時(shí)間、離心速度和不同苗齡對(duì)青稞原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，旨在確定青稞原生質(zhì)體制備的最優(yōu)體系，為利用青稞原生質(zhì)體做進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)材料。本試驗(yàn)選用由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院提供的青稞“肚里黃”品種。

(2)試劑。纖維素酶(Cellulase-R10)、果膠酶(Macerozyme-R10)、牛血清蛋白(BSA)、甘露醇、二乙酸熒光素(FDA)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選擇3%纖維素酶和1%果膠酶作為酶液組合。以甘露醇濃度、酶解時(shí)間、離心速度和不同苗齡為主要因素(表1)，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，如表2所示。表中各因素各水平均參照文獻(xiàn)[8]。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2 青稞幼苗的培養(yǎng) 選取20粒飽滿的青稞“肚里黃”種子，先用30%H2O2浸泡消毒10 min，再用無菌水沖洗5～7次，隨后將種子在培養(yǎng)皿中用無菌水浸泡12 h后轉(zhuǎn)移到紙床(鋪好濾紙的培養(yǎng)皿),排列整齊，放置黑暗環(huán)境下萌發(fā)48 h，期間注意在濾紙變干前澆水(以澆透濾紙為準(zhǔn))；將已萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移至改良的Hoagland′s水培體系中室溫培養(yǎng)，每隔2 d更換一次新鮮營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.3 青稞原生質(zhì)體制備 將培養(yǎng)的不同苗齡青稞幼葉沿根部剪下，用75%的酒精對(duì)葉片表面進(jìn)行消毒，然后稱取1.5 g并切成0.5～1 mm左右的小碎片，將其放入15 mL酶解液中(3%纖維素酶+1%果膠酶+甘露醇+0.1%MES+1 mmol/L CaCl22H2O+0.1%BSA)，25 ℃、60 r/min黑暗條件放置搖床振蕩酶解。待酶解結(jié)束，用200目細(xì)胞篩過濾去除較大的細(xì)胞壁或組織碎片，濾液重新裝入15 mL圓底離心管中，25 ℃離心5 min，收集管底沉淀物，棄上清。向管底加入3 mL W5(154 mmol/L NaCl+125 mmol/L CaCl22H2O+5 mmol/L KCl+2 mmol/L MES，pH 5.7)溶液清洗3次，離心棄上清；最后向管底加入1 mL W5溶液將沉淀進(jìn)行吹打混勻，獲得純化的原生質(zhì)體。

原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的測(cè)定參照尹紅新[9]和彭小群等[10]方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)條件的確定

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析可知(表3)，甘露醇濃度的R值最大，說明甘露醇濃度對(duì)青稞葉片原生質(zhì)體影響較大；其次為酶解時(shí)間和離心速度，酶解時(shí)間過長(zhǎng)、離心速度過大都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多，影響青稞葉片原生質(zhì)體活力；不同苗齡對(duì)青稞葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量影響較小。綜合考慮，上述4個(gè)因素對(duì)青稞葉片原生質(zhì)體的影響主次順序?yàn)楦事洞紳舛?酶解時(shí)間>離心速度>不同苗齡。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

2.2 LSD多重比較分析

對(duì)各因素各水平進(jìn)行LSD多重比較分析。甘露醇濃度太高或太低都會(huì)影響原生質(zhì)體分離的效果，當(dāng)甘露醇濃度為0.5 mol/L時(shí)，分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都最好，顯著高于其他兩組(圖1a)；如圖1b所示，酶解5 h時(shí)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都最高，繼續(xù)增加酶解時(shí)間(6 h)，原生質(zhì)體產(chǎn)量開始下降，活力也隨之減少；通過500、900、1 200 r/min離心速度對(duì)原生質(zhì)體分離的研究發(fā)現(xiàn)，完整原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力在900 r/min時(shí)最好(圖1c)；以培養(yǎng)5、7、9 d的青稞幼葉為材料，分析不同苗齡對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，從圖1d可以看出，不同苗齡的青稞幼葉原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力沒有明顯差異，這可能與極差最小有關(guān)，說明相差一兩天的培養(yǎng)天數(shù)對(duì)其產(chǎn)量和活力影響并不大。結(jié)合上述分析，確定制備青稞葉片原生質(zhì)體的最優(yōu)條件：培養(yǎng)7 d的青稞幼葉為材料，酶解液由3%纖維素酶+1%果膠酶+0.5 mol/L甘露醇+0.1% MES+1 mmol/L CaCl22H2O+0.1% BSA組成，25 ℃，60 r/min，黑暗酶解5 h后，用900 r/min離心5 min收集。

圖1 不同因素水平下原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的均值比較Fig.1 Comparison of mean yield and activity of protoplast at different factor levels

2.3 最優(yōu)條件下分離的原生質(zhì)體

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和LSD多重比較分析，確定分離原生質(zhì)體過程中4個(gè)影響因素的最優(yōu)條件。將培養(yǎng)7 d的青稞幼葉放入含有0.5 mol/L甘露醇的酶解液中，黑暗酶解5 h，然后以900 r/min的離心速度收集細(xì)胞，對(duì)分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察(圖2)，結(jié)果顯示在最優(yōu)條件下分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)3.2×106個(gè)/g，活力約為85.42%。同時(shí)，分離出來的完整原生質(zhì)體呈飽滿的圓球形(圖2a)，通過FDA染色會(huì)發(fā)出綠色熒光(圖2b)。

圖2 最優(yōu)條件下青稞原生質(zhì)體的顯微觀察Fig.2 Microscopic observation of Hordeum vulgare L.var.nudum.protoplast under the optimal condition

3 討論與結(jié)論

原生質(zhì)體制備過程中，甘露醇濃度過高細(xì)胞質(zhì)會(huì)失水過度而皺縮，濃度過低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)脹裂破碎。趙紅娟等[6]在苜蓿子葉原生質(zhì)體分離中使用的甘露醇濃度為0.2～0.8 mol/L，本研究使用的甘露醇濃度為0.5 mol/L，此條件下分離的原生質(zhì)體細(xì)胞壁破碎完全，細(xì)胞質(zhì)周圍環(huán)境穩(wěn)定，最終收獲的原生質(zhì)體大多呈飽滿球形，活力較高。彭小群等[10]的研究發(fā)現(xiàn)酶解時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)分離原生質(zhì)體影響較大。本研究中青稞幼葉酶解4 h時(shí)只有很少量的細(xì)胞壁碎片，酶解6 h時(shí)產(chǎn)量雖有所提高，但細(xì)胞碎片數(shù)量過多，影響細(xì)胞質(zhì)的活力。因此，確定原生質(zhì)體分離的最佳酶解時(shí)間為5 h，該時(shí)間段完整細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)量多、碎片少、活力高。收集原生質(zhì)體時(shí)離心速度太小會(huì)導(dǎo)致其沉淀不完全，離心速度太大會(huì)使過早沉淀下來的原生質(zhì)體被壓實(shí)且破碎[11]。本試驗(yàn)中當(dāng)離心速度為900 r/min，離心5 min時(shí)，原生質(zhì)體沉淀最為徹底，最終獲得的完整原生質(zhì)體產(chǎn)量最多。不同苗齡的青稞幼葉對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力影響不大，培養(yǎng)7 d的青稞幼葉分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均較高。

建立高效的原生質(zhì)體分離純化體系對(duì)于亞細(xì)胞定位、體細(xì)胞雜交和瞬時(shí)表達(dá)等試驗(yàn)十分重要[12]。本研究確定的最優(yōu)條件為纖維素酶3%，果膠酶1%，甘露醇濃度0.5 mol/L，酶解時(shí)間5 h，離心速度900 r/min，從培養(yǎng)7 d的青稞幼葉中分離出的細(xì)胞質(zhì)呈圓球形，多為淡綠色，分布均勻，產(chǎn)量可達(dá)3.2×106個(gè)/g，活力約為85.42%。