蔣湘 魏亦彤 許樂樂 呂美霞 朱文燕 王鋰韞 陳道海

(1 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048；2 廣東省粵西海鮮資源可持續(xù)利用工程技術(shù)研究中心，廣東湛江 524048)

鹵蟲(Artemiasaline)又稱鹽水豐年蟲、豐年蝦、鹽蝦或鰓足蟲，為廣溫耐高鹽型甲殼動(dòng)物。鹵蟲隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門，甲殼亞門，鰓足綱，無甲目，鹽水豐年蟲科，鹵蟲屬(Artemia)[1]，在世界各地沿海高鹽水域、海岸鹽田及內(nèi)陸鹽湖等均有分布，中國(guó)主要產(chǎn)地為長(zhǎng)江以北沿海及內(nèi)陸等地，天津長(zhǎng)蘆鹽場(chǎng)是我國(guó)最著名的鹵蟲產(chǎn)地[2]。鹵蟲具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值，其生長(zhǎng)迅速，繁殖周期短，幼體和成蟲富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、礦物質(zhì)等，是海水養(yǎng)殖的優(yōu)良餌料和天然誘食劑[2-3]。鹵蟲能濾食鹽田中的藻類和固體懸浮顆粒，改良水質(zhì)，提高產(chǎn)鹽質(zhì)量[4]，因其生活習(xí)性和特殊的生理結(jié)構(gòu)常被應(yīng)用于環(huán)境污染物評(píng)價(jià)和生態(tài)毒理學(xué)研究中，被列為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)生物[5-6]。近年來，我國(guó)沿海各地已經(jīng)開始大規(guī)模養(yǎng)殖鹵蟲。

孵化率是鹵蟲卵質(zhì)量的1個(gè)重要指標(biāo)。光照強(qiáng)度作為影響鹵蟲孵化效果的關(guān)鍵因素之一，國(guó)內(nèi)外已有較多的研究報(bào)道。Linden等[7]研究表明，光照對(duì)鹵蟲孵化具有顯著刺激效果；王忠良等[8]通過響應(yīng)面法分析了光照強(qiáng)度和鹽度對(duì)鹵蟲休眠卵孵化率的聯(lián)合效應(yīng)，并建立了光照強(qiáng)度、鹽度和鹵蟲孵化率的實(shí)際二次回歸方程；張強(qiáng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度的大小對(duì)巴里坤湖鹵蟲卵孵化的同步性沒有顯著影響，但是否有光照對(duì)孵化的同步性有明顯影響，有無光照對(duì)最后測(cè)定時(shí)(48 h)的孵化率沒有顯著影響；張閏生等[10]的研究顯示，孵化2 h后用日光燈照射1 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx時(shí)可以得到較好的孵化效果；Asil等[11]也研究了光照強(qiáng)度對(duì)鹵蟲孵化及生長(zhǎng)參數(shù)的影響。本研究在前人研究基礎(chǔ)上開展光照強(qiáng)度對(duì)天津品系鹵蟲孵化率的影響，以期為室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖環(huán)境下提高鹵蟲孵化率提供相關(guān)參考數(shù)據(jù)。

室外人工養(yǎng)殖鹵蟲成活率偏低，產(chǎn)量不穩(wěn)定，所產(chǎn)出的鹵蟲個(gè)體大小不均勻、顏色偏白，影響了鹵蟲的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在室內(nèi)封閉式循環(huán)水養(yǎng)殖環(huán)境下提高鹵蟲養(yǎng)殖的存活率可以很大程度上減少對(duì)自然界鹽湖鹽田鹵蟲資源的依賴。室內(nèi)工廠化養(yǎng)殖的顯著特點(diǎn)是節(jié)水、零排放，而海水來源或者養(yǎng)殖所需的海水類型等也是在遠(yuǎn)海地區(qū)開展養(yǎng)殖首要考慮的因素。選擇1種適用、廉價(jià)、來源廣、運(yùn)輸便利的海水類型能大大降低工廠化養(yǎng)殖的運(yùn)行成本，提高產(chǎn)品的潛在價(jià)值和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。目前已有相關(guān)學(xué)者開展了對(duì)鹵蟲無節(jié)幼體存活率的研究。茹文紅等[12]研究了4種不同餌料對(duì)不同產(chǎn)地鹵蟲幼體的存活率；馬婷等[13-14]開展了鹽度、光照強(qiáng)度、pH及餌料對(duì)鹵蟲幼體存活率影響的研究；Naceur等[15]在實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)殖條件下研究了4種不同種類非洲突尼斯鹵蟲存活率的差異。以上相關(guān)研究均是從餌料、鹽度、pH等方面開展鹵蟲幼體單因子的存活率試驗(yàn)，但海水類型與溫度雙因子聯(lián)合對(duì)鹵蟲存活率的研究尚未見報(bào)道。本研究采用雙因素方差分析法研究溫度、海水類型及交互效應(yīng)對(duì)鹵蟲存活率的影響，旨在為后續(xù)開展室內(nèi)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖，提高鹵蟲存活率和穩(wěn)定的產(chǎn)出率提供實(shí)際參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年7月20日在湛江嶺南師范學(xué)院水生動(dòng)物實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)所用鹵蟲休眠卵由湛江海神生物科技發(fā)展有限公司提供(天津品系)，孵化所用鹵水來自湛江坡頭區(qū)南三島南三鹽場(chǎng)，鹵水鹽度為60，試驗(yàn)用水處理流程依次為：過濾、消毒、曝氣、沉淀、增氧。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

孵化率試驗(yàn)：設(shè)置0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 lx共6個(gè)光照強(qiáng)度組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，0 lx組一直保持用黑色塑料膜覆蓋遮光，其他光照強(qiáng)度通過調(diào)節(jié)燒杯與光源的距離來實(shí)現(xiàn)，采用數(shù)字照度計(jì)(VICTOR 1010D型，深圳驛生勝利科技有限公司)進(jìn)行測(cè)定。鹵蟲休眠卵孵化率的測(cè)定參考王基琳[16]的動(dòng)態(tài)鏡檢方法并略做改進(jìn)。電子天平上準(zhǔn)確稱取0.1 g鹵蟲卵倒入500 mL燒杯中，加入鹽度30的鹵水500 mL，浸泡30 min后充氣，調(diào)節(jié)充氣量，保持有連續(xù)氣泡產(chǎn)生即可，使鹵蟲卵均勻懸浮于水中，用50 μL移液槍采取隨機(jī)方式分40次取樣于培養(yǎng)皿內(nèi)，分別于解剖鏡下計(jì)數(shù)，得到樣品中的平均鹵蟲卵密度，計(jì)算得到0.1 g鹵蟲卵的總數(shù)，在水溫28 ℃下充氣孵化28 h后，用50 μL移液槍多次取樣測(cè)定水中平均無節(jié)幼體的密度，計(jì)算得到無節(jié)幼體的總數(shù)。孵化率按照以下公式計(jì)算：

(1)

式(1)中，Ni為無節(jié)幼體數(shù)，Ci為鹵蟲卵數(shù)。

存活率試驗(yàn)：設(shè)置2種試驗(yàn)溫度，分別為A1(25.17±0.51)℃、A2(32.03±1.04)℃；5種海水類型，分別為B1(鹵水)、B2(鹵水+自來水)、B3(海水晶+自來水)、B4(海水晶+純凈水)、B5(天然海水)，其中B1鹽度為60，B2、B3、B4、B5鹽度均為30。每個(gè)水平組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。試驗(yàn)容器為直徑11 cm、高3 cm的食品級(jí)塑料桶，有效水體200 mL，每個(gè)容器放30只剛孵出、活力較好的鹵蟲無節(jié)幼體，于恒溫培養(yǎng)箱中開展48 h靜水培育試驗(yàn)，僅在24 h時(shí)所有試驗(yàn)組投喂少量通過孔徑75 μL篩網(wǎng)過濾的螺旋藻粉懸液，6、24、48 h時(shí)分別檢查所有試驗(yàn)組死亡鹵蟲幼體的數(shù)量，記錄數(shù)據(jù)并用吸管取出。死亡鹵蟲幼體判斷標(biāo)準(zhǔn)為：幼體沉于底部，觸碰其附肢10 s不動(dòng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果和分析

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)鹵蟲卵孵化率的影響

光照強(qiáng)度對(duì)鹵蟲的孵化率結(jié)果如圖1所示。光照強(qiáng)度0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 lx下的鹵蟲孵化率分別為(5.12±2.18)%、(55.68±4.73)%、(59.66±13.04)%、(62.50±19.51)%、(48.29±10.06)%、(38.07±11.04)%。方差分析結(jié)果表明，不同光照強(qiáng)度的孵化率存在顯著差異(P<0.05)，3 000 lx組孵化率極顯著大于0、5 000 lx組(P<0.01)；5 000 lx組極顯著大于0 lx組(P<0.01)；1 000、2 000、3 000、4 000 lx組間無顯著差異(P>0.05)。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；下同。Note:different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05),and different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01)；the same below.圖1 光照強(qiáng)度對(duì)鹵蟲卵孵化率的影響Fig.1 Effect of light intensity on hatchability of Artemia saline eggs

2.2 溫度、海水類型對(duì)鹵蟲存活率的影響

溫度和海水類型對(duì)鹵蟲存活率的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明，孵化后6 h時(shí)，不同溫度、海水類型及其交互效應(yīng)對(duì)鹵蟲存活率的影響無顯著差異(P>0.05)。

表1 溫度和海水類型對(duì)鹵蟲存活率的影響結(jié)果Tab.1 Effects of temperature and seawater type on the survival rate of Artemia saline 單位：%

孵化后24 h時(shí)，方差分析結(jié)果表明，不同溫度、海水類型及其交互效應(yīng)對(duì)鹵蟲存活率影響有顯著差異(P<0.05)，其中不同海水類型對(duì)鹵蟲存活率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。兩個(gè)因素的交互效應(yīng)對(duì)鹵蟲存活率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果如圖2所示。A1B1、A2B2組的存活率相同，均為(98.89±1.92)%，顯著高于A2B4、A2B3、A1B4、A1B3組(P<0.05)，其中A2B4組存活率最低，僅為(22.22±1.92)%，其余試驗(yàn)組間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 24 h鹵蟲存活率LSR法多重比較結(jié)果Fig.2 Multiple comparison of 24 h survival rate of A. saline by LSR method

孵化后48 h時(shí)的分析結(jié)果表明，溫度和海水類型對(duì)鹵蟲幼體的存活率有極顯著影響(P<0.01)，溫度與海水類型的交互效應(yīng)對(duì)存活率有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，A1B1組存活率最高，為(97.78±1.92)%；A1B2組其次，為(96.67±3.35)%；A1B1組與A1B2組間無顯著差異(P>0.05)。A1B1、A1B2組極顯著大于A2B1、A1B3、A1B4、A2B3、A2B4組(P<0.01)。A2B4組鹵蟲幼體存活率最低，僅為(2.22±1.92)%，與A1B4、A2B3組無顯著差異(P>0.05)，但均顯著低于其余的試驗(yàn)組(P<0.05)。

圖3 48 h鹵蟲存活率LSR法多重比較結(jié)果Fig.3 Multiple comparison of 48 h survival rate of A. saline by LSR method

3 討論

3.1 光照強(qiáng)度對(duì)孵化率的影響

孵化率是衡量鹵蟲卵質(zhì)量最重要的指標(biāo)。鹵蟲卵品系、來源和孵化條件等都是影響孵化率的重要因素。其中孵化條件包括水體的溫度、鹽度、pH、溶解氧及光照強(qiáng)度等因子[8]。孫朦朦等[17]對(duì)產(chǎn)地為哈薩克斯坦巴普洛達(dá)爾州伯爾利湖的鹵蟲卵開展研究，結(jié)果顯示，光照強(qiáng)度3 000 lx下鹵蟲的孵化率最高，為(62.00±0.04)%；張閏生等[10]的研究結(jié)果顯示，光照強(qiáng)度為2 000 lx時(shí)，天津品系鹵蟲的孵化率最優(yōu)，為69.31%；王忠良等[8]的研究表明，光照強(qiáng)度2 134 lx、鹽度31.57為鹵蟲最適孵化條件，其孵化率為29.86%；潘正軍等[18]研究表明，2 000 lx是西藏鹵蟲卵孵化的最適光照強(qiáng)度，在此條件下孵化率為(77.41±4.06)%，而光照強(qiáng)度為2 000 lx與3 000 lx條件下的孵化率無顯著差異(P>0.05)。本試驗(yàn)以天津品系鹵蟲為研究對(duì)象，采用單因素方差分析法研究了不同光照強(qiáng)度下的鹵蟲孵化率，結(jié)果表明，光照強(qiáng)度對(duì)鹵蟲孵化率有顯著影響(P<0.05)，適宜的光照強(qiáng)度為1 000～4 000 lx，孵化率為(48.29±10.06)%～(62.50±19.51)%，最適光照強(qiáng)度為3 000 lx。試驗(yàn)結(jié)果與孫朦朦等[17]、張閏生等[10]的研究結(jié)果相近，但高于王忠良等[8]、低于潘正軍等[18]的研究結(jié)果。分析原因，可能是王忠良等[8]采用靜水孵化的方式開展研究，部分鹵蟲卵吸水后沉于底部，對(duì)孵化結(jié)果有一定影響，導(dǎo)致所得到孵化率低于本研究的結(jié)果；而潘正軍等[18]所用的材料為西藏品系鹵蟲卵，且鹵蟲卵的孵化環(huán)境有所不同。Vanhaecke等[19]指出，不同品系的鹵蟲，其最適的光照強(qiáng)度有所差異。筆者認(rèn)為，引起差異的原因除了試驗(yàn)所用鹵蟲品系不同外，孵化環(huán)境的差異更值得關(guān)注，試驗(yàn)水體中有機(jī)物、微生物、藻類、無機(jī)鹽的成分含量等與人工配制海水有所不同，因而會(huì)引起孵化結(jié)果的差異。

3.2 溫度和海水類型對(duì)鹵蟲幼體存活率的影響

廖承義等[20]的研究顯示，鹵蟲幼體在孵出后40 h內(nèi)可依靠自身卵黃提供營(yíng)養(yǎng)而存活，試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)在48 h內(nèi)只需投喂少量餌料，因此，本研究挑選剛孵出的幼體開展溫度和海水類型對(duì)鹵蟲幼體存活率的影響試驗(yàn)，以最大限度減少餌料、藻類、水體營(yíng)養(yǎng)等因子的干擾。李景等[21]的研究表明，鹵蟲幼體的最適生長(zhǎng)溫度為26 ℃；王中秋[22]指出，鹵蟲最適的生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，能耐受的極限溫度為6～35 ℃；陳新旦等[23]研究了鹽度、溫度2個(gè)因子聯(lián)合效應(yīng)對(duì)鹵蟲生長(zhǎng)和存活的影響，結(jié)果表明，鹽度與溫度的交互效應(yīng)影響顯著，鹵蟲最佳生長(zhǎng)和存活的溫度為28 ℃，當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時(shí)，其存活時(shí)長(zhǎng)為5 d。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相比(32.03±1.04)℃的溫度條件，溫度(25.17±0.51)℃更適合鹵蟲幼體存活，這與上述研究結(jié)果相近。

海水是工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖非常重要的環(huán)境因子。目前尚未見有關(guān)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖鹵蟲中海水類型選擇的研究報(bào)道。鄭超群[24]進(jìn)行了海水酸化條件下中國(guó)鹵蟲(Artemiasinica)生理響應(yīng)的研究，結(jié)果顯示，海水酸化會(huì)降低鹵蟲的孵化率和存活率，并抑制鹵蟲生長(zhǎng)，但對(duì)鹵蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)無明顯影響。酸化會(huì)引起海水pH下降，海水pH對(duì)鹵蟲的存活有顯著影響[10]。本試驗(yàn)中，鹵水+自來水、鹵水、天然海水的pH值要高于海水晶+自來水、海水晶+純凈水，但并沒有顯著的差異。試驗(yàn)結(jié)果按鹵蟲存活率的排序?yàn)椋築2(鹵水+自來水)≥B1(鹵水)≥B5(天然海水)≥B3(海水晶+自來水)≥B4(海水晶+純凈水)，其中鹵水+自來水組鹵蟲的存活率最高，海水晶+純凈水組存活率最低。這可能是由于水中化學(xué)物質(zhì)組成的差異，海水晶的化學(xué)物質(zhì)組成與鹵水或天然海水不同，甚至可能會(huì)缺少一些鹵蟲存活必需的化學(xué)物質(zhì)。

溫度與海水類型的交互效應(yīng)對(duì)鹵蟲幼體存活率有顯著的影響。單一因子方面，水溫在(25.17±0.51)℃時(shí)，鹵蟲平均存活率為(62.89±4.07)%，鹵水+自來水組的平均存活率為(95.00±3.49)%，分別是其各自最優(yōu)的水平。該水平組合的平均存活率為(96.67±3.35)%，高于兩個(gè)因子單獨(dú)作用之和的均值，這表明溫度與海水類型兩個(gè)因子之間存在顯著的正交互效應(yīng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，溫度(25.17±0.51)℃+純鹵水才是最優(yōu)的水平組合，在此條件下，鹵蟲的平均存活率為(97.78±1.92)%，高于在溫度(25.17±0.51)℃下鹵水+自來水的組合，這可能是由于同一溫度在不同類型的海水中交互效應(yīng)不同導(dǎo)致的。綜合考慮存活率、鹵水價(jià)格、運(yùn)輸成本、運(yùn)行損耗等因素，在溫度(25.17±0.51)℃下采用鹵水+自來水的方法更為經(jīng)濟(jì)和便利，更加適合于循環(huán)水養(yǎng)殖條件。