乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位的異質(zhì)性

劉 欣，陳梅春，劉 蕓，鄭雪芳，陳 崢，王階平，劉 波

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003）

生態(tài)位反映了生物體在其群落中機(jī)能作用和地位，包括了時間、空間、營養(yǎng)、代謝、生理、環(huán)境條件等資源利用的情況[1-2]。目前，關(guān)于微生物生態(tài)位研究已成為研究的熱點。Okie等[3]利用生態(tài)位和代謝原理解釋土壤細(xì)菌多樣性和分布模式；Hunting等[4]發(fā)現(xiàn)，資源生態(tài)位重疊能夠促進(jìn)微生物群落代謝的穩(wěn)定性；Essarioui等[5]研究發(fā)現(xiàn)，根際鏈霉菌（Streptomycetaceae）和鐮刀菌（Fusarium）生態(tài)位重疊會導(dǎo)致種群間的抑制作用和資源競爭；劉波等[6]報道了養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽孢桿菌（Bacillus）空間生態(tài)位特性，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌生態(tài)位寬度與空間分布型指數(shù)擁擠度M*呈顯著正相關(guān)；同時發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌發(fā)酵過程脂肪酸組的結(jié)構(gòu)變化與其生理生化特性的變化相關(guān)，也成為芽孢桿菌適應(yīng)外界生長條件，如溫度、pH值、鹽分等的指標(biāo)。

乳酸菌是一類重要益生菌，其發(fā)酵過程產(chǎn)生豐富的脂肪酸組[7-8]。研究表明，微生物脂肪酸組具有種屬遺傳穩(wěn)定性，能夠作為生物標(biāo)記示蹤物質(zhì)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，韓世忠等[9]利用脂肪酸組分析了中亞熱帶地區(qū)兩種森林植被類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)；李森森等[10]將脂肪酸組用于濕地土壤微生物群落分析；張秋芳等[11]利用脂肪酸組差異性研究施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響；郭海超[12]利用脂肪酸組研究了磷礦粉在水稻土中的溶解-轉(zhuǎn)化特性及生物有效性；鄭雪芳等[13]進(jìn)行了養(yǎng)豬發(fā)酵床不同發(fā)酵程度墊料微生物群落結(jié)構(gòu)特征磷脂脂肪酸分析；Suutari[14]、Herman[15]、Klein[16]、Haque[17]、Sikorski[18]等對芽孢桿菌脂肪酸對溫度的適應(yīng)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌脂肪酸的組成和含量會隨溫度變化作出相應(yīng)調(diào)整，從而產(chǎn)生耐高溫和耐低溫的脂肪酸。然而，有關(guān)乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位的異質(zhì)性研究鮮見報道。在相同培養(yǎng)條件下，不同種類的乳酸菌發(fā)酵生長過程產(chǎn)生的脂肪酸組結(jié)構(gòu)差異顯著，在乳酸菌發(fā)酵液中形成了脂肪酸組生態(tài)位資源梯度，影響乳酸菌生理生化特性，進(jìn)而影響乳酸菌的生長；研究乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位資源的異質(zhì)性對于了解其培養(yǎng)組特性、生理生化特性、環(huán)境條件變化生長的適應(yīng)性具有重要意義。

本研究探究不同種類乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組變化及其對生長特性影響的反饋，分析不同乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組成，研究乳酸菌生長能力與脂肪酸含量關(guān)系；構(gòu)建脂肪酸組生態(tài)位寬度和重疊生態(tài)學(xué)指標(biāo)，分析乳酸菌發(fā)酵階段脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊等變化，闡述生態(tài)位變化的異質(zhì)性，討論乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位寬度與重疊的相互關(guān)系，旨在為乳酸菌生長特性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumFJAT-13737）、德氏乳桿菌（L.delbrueckiiFJAT-43773）、副干酪乳桿菌（L.paracaseiFJAT-13741）、鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosusFJAT-13807）、短乳桿菌（L.brerisFJAT-43776）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentumFJAT-13771）、嗜酸乳桿菌（L.acidophilusFJAT-13772）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilusFJAT-43774），保存于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所微生物菌種保存中心。

KOH、冰醋酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚（均為色譜級）默克化工技術(shù)（上海）有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微生物全自動脂肪酸測定儀 美國安捷倫科技有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；STIK恒溫培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌培養(yǎng)與檢測

1.3.1.1 乳酸菌菌種制備

種子液制備：無菌操作將不同的乳酸菌平板樣品取25 mg放入225 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中搖勻，置于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，取出置于4 ℃冰箱，用平板稀釋法計數(shù)法計數(shù)乳酸菌活菌數(shù)，調(diào)整濃度至1×108CFU/mL，制作成同一濃度的種子液備用。

活菌計數(shù)：采用平板稀釋計數(shù)法，將乳酸菌發(fā)酵液依次遞增稀釋后均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基（含有0.5% CaCO3）平板上，置于37 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，48 h后觀察菌落形態(tài)，計數(shù)菌落數(shù)，計算活菌數(shù)，每個處理3 個重復(fù)，統(tǒng)計平均值?；罹鷶?shù)計算如式（1）所示：

1.3.1.2 乳酸菌發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基的制備：制備荔枝汁-大豆蛋白復(fù)合培養(yǎng)基，將荔枝汁和豆?jié){按1∶1比例混合，再加入2%的白砂糖，分裝于250 mL藍(lán)蓋瓶中，滅菌，每瓶200 mL荔枝汁-豆?jié){混合液，備用。

乳酸菌發(fā)酵：將供試的8 種乳酸菌分別接種于荔枝汁-大豆蛋白復(fù)合培養(yǎng)基，接種量為3%，混勻分裝至100 mL藍(lán)蓋瓶中，每瓶裝量80 mL，每個處理重復(fù)3 次，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。

發(fā)酵取樣：乳酸菌發(fā)酵取樣時間為1、6、12、18、24、30、36、42 h和48 h，每次取樣12 mL，用于分析pH值、酸度值、活菌數(shù)（參照1.3.1.1節(jié)活菌計數(shù)法）以及發(fā)酵液脂肪酸組。

1.3.1.3 乳酸菌發(fā)酵過程活菌數(shù)計算

采用平板稀釋計數(shù)法（如上所述），每個樣本吸取200μL至相應(yīng)濃度的平板上，溶液滴至平板中央，將涂好的平板用塑料袋裝好，倒置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計培養(yǎng)平板上菌落數(shù)，算出同一稀釋度的菌落平均數(shù)。

1.3.2 脂肪酸組分析

1.3.2.1 樣品脂肪酸的提取

取10 g乳酸菌發(fā)酵液于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2 mol/L的KOH溶液，充分混勻，渦旋樣品5 min，37 ℃水浴1 h，每10 min振蕩樣品1 次；加入3 mL 1.0 mol/L醋酸溶液，充分搖勻；加入10 mL正己烷，充分搖勻，2 000 r/min離心15 min，將上層正己烷相轉(zhuǎn)入干凈玻璃試管中，吹干；加入試劑40.6 mL正己烷-甲基叔丁基醚溶液（1∶1，V/V）后用于脂肪酸測定。

1.3.2.2 樣品脂肪酸成分氣相色譜-質(zhì)譜檢測

脂肪酸組分析采用微生物全自動脂肪酸測定儀，氣相色譜條件：初始溫度170 ℃，以5 ℃/min升至260 ℃，以40 ℃/min升至310 ℃，維持90 s；氣化室溫度250 ℃；檢測器溫度300 ℃；載氣為H2（2 mL/min），進(jìn)樣模式為分流進(jìn)樣，分流比為100∶1；輔助氣流速：空氣（350 mL/min）和H2（30 mL/min）；尾吹氣流速為N2（30 mL/min）；柱前壓10.00 psi；進(jìn)樣量1 μL。

1.3.3 統(tǒng)計分析

1.3.3.1 乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組聚類分析

利用DPS軟件（v16.05）進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組聚類分析，以乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸組為樣本，不同乳酸菌的不同發(fā)酵時間為指標(biāo)，以卡方距離為尺度，采用可變類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類。

1.3.3.2 乳酸菌發(fā)酵階段發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊分析

利用DPS軟件對乳酸菌不同發(fā)酵時間1 h（初期）、24 h（中期）、48 h（后期）發(fā)酵液脂肪酸組的生態(tài)位寬度和重疊進(jìn)行計算分析，比較不同乳酸菌的不同發(fā)酵階段生態(tài)位寬度和重疊及其變化。

生態(tài)位寬度計算：以發(fā)酵過程為單位，乳酸菌種類為樣本，脂肪酸組為指標(biāo)，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，用Levins測度計算不同發(fā)酵時間乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位寬度（B）[19]。分析軟件采用DPS v16.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。計算如式（2）所示：

式中：Pi為第i個脂肪酸資源的含量比例。

生態(tài)位重疊計算：以發(fā)酵過程為單位，乳酸菌種類為樣本，脂肪酸組為指標(biāo)，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，用Pianka測度計算乳酸菌之間生態(tài)位重疊[20]。計算如式（3）所示：

式中：Oik為乳酸菌第i種和第k種的生態(tài)位重疊值：nij和nkj為乳酸菌第i種和第k種在脂肪酸資源j中所占的含量比例；r為脂肪酸種類總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組成分析

2.1.1 脂肪酸組成分析

脂肪酸主要存在于細(xì)菌細(xì)胞壁上，脂肪酸種類和含量比例具有細(xì)菌種屬遺傳穩(wěn)定性，可作為鑒定細(xì)菌種類的特征標(biāo)記[21]。本研究對乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組進(jìn)行研究，不同乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組成如表1所示。結(jié)果表明，從8 種乳酸菌發(fā)酵液中共檢測到脂肪酸91 個，其中直鏈脂肪酸12 個、支鏈脂肪酸70 個、未能分離的脂肪酸9 個。

表1 乳酸菌發(fā)酵過程脂肪酸組成Table 1 Analysis of fatty acid composition in the fermentation broth of lactic acid bacteria

乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組研究報道很少，僅見到一些關(guān)于乳酸菌發(fā)酵過程作為產(chǎn)物分析的脂肪酸研究報道。陸春波等[22]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸（癸酸、辛酸、壬酸）是植物乳桿菌DY6的重要抑菌代謝物；劉露等[23]報道了乳酸菌體外發(fā)酵山藥低聚糖能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，可維持腸道與人體健康。本研究在荔枝汁-大豆蛋白培養(yǎng)基和37 ℃條件下，分別發(fā)酵的8 種乳酸菌發(fā)酵液中脂肪酸組共檢測到91 個生物標(biāo)記，完整地分析了乳酸菌的脂肪酸組，鮮見相關(guān)研究報道。

2.1.2 脂肪酸組聚類分析

不同發(fā)酵時期不同乳酸菌的發(fā)酵液脂肪酸組種類增減和含量變化差異顯著。以72 個取樣單元為矩陣，脂肪酸組為樣本，不同乳酸菌的不同發(fā)酵時間為指標(biāo)，數(shù)據(jù)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化，卡方距離為尺度，用可變類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌發(fā)酵過程脂肪酸組聚類分析Fig.1 Cluster analysis of fatty acids during fermentation of lactic acid bacteria

可將乳酸菌發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸組分為3類，第1類為乳酸菌高含量脂肪酸，包含了5 個脂肪酸，即C14:0、C16:0、C18:0、C18:1ω9c、Sum In Feature 5（C18:2ω6,9c/C18:0ante），占比65.37%，該類脂肪酸具有種屬識別特征，這5 個脂肪酸生物標(biāo)記可以用于監(jiān)測乳酸菌發(fā)酵過程活菌數(shù)的變化[24]；第2類為乳酸菌中含量脂肪酸組，包含了15 個脂肪酸，即C10:0、C12:0、C15:0、C17:0、C14:1ω5c、C17:0anteiso、C17:0iso、C17:1ω10ciso、C17:1ω8c、C18:010-methyl,TBSA、C18:1ω5c、C19:1iso I、Sum In Feature 3（C16:1ω7c/C16:1ω6c）、Sum In Feature 4（C17:1iso I/anteiso B）、Sum In Feature 8（C18:1ω7c/C18:1ω6c），占比19.44%，這些脂肪酸指示著乳酸菌功能作用；第3類為低含量脂肪酸，包含了其余的71 個脂肪酸，占比15.71%，為生理調(diào)控信號脂肪酸。不同的脂肪酸體現(xiàn)了不同的功能信號。張?zhí)礻朳25]研究發(fā)現(xiàn)，豬飼喂乳酸菌后，豬肌肉中豆蔻酸（C14:0）、十七碳酸（C17:0）、亞油酸（C18:2）含量有顯著上升，油酸（C18:l）含量顯著降低，顯著提升了肌肉中氨基酸含量，提高豬肉的抗氧化性；袁崢[26]發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌可通過增加不飽和脂肪酸的含量和碳鏈長度降低細(xì)胞膜對H+的透過性，防止細(xì)胞膜內(nèi)的pH值迅速下降；游剛等[27]研究發(fā)現(xiàn)，腌干魚接種乳酸菌后，棕櫚油酸（C16:0）和十八酸（C18:0）的含量減少，不飽和脂肪酸花生四烯酸（C20:4）和二十碳五烯酸（C20:5）含量增加，一定程度上提升了魚肉的營養(yǎng)價值。

2.2 乳酸菌生長能力與脂肪酸含量關(guān)系

2.2.1 乳酸菌生長能力的比較

圖2 不同乳酸菌生長能力的比較Fig.2 Comparison of growth capacity of different lactic acid bacteria

圖2 不同乳酸菌生長能力的比較Fig.2 Comparison of growth capacity of different lactic acid bacteria從圖2可以看出，不同乳酸菌生長能力差異顯著，生長能力最強(qiáng)的為鼠李糖乳桿菌FJAT-13807；最低的為嗜熱鏈球菌FJAT-43774。不同乳酸菌活菌數(shù)峰值出現(xiàn)的時間不同，24 h出現(xiàn)峰值的有短乳桿菌FJAT-43776、發(fā)酵乳桿菌FJAT-13771、嗜酸乳桿菌FJAT-13772、嗜熱鏈球菌FJAT-43774；30 h出現(xiàn)峰值的有植物乳桿菌FJAT-13737、副干酪乳桿菌FJAT-13741、鼠李糖乳桿菌FJAT-13807；而德氏乳桿菌FJAT-43773峰值出現(xiàn)的最遲，在36 h。

2.2.2 乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸含量的比較

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵過程脂肪酸含量的比較Fig.3 Comparison of fatty acid contents in the fermentation broth of lactic acid bacteria during fermentation

從圖3可知，不同乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸代謝能力差異顯著，發(fā)酵過程發(fā)酵液脂肪酸總量累計值最高的是短乳桿菌FJAT-43776；最低的是鼠李糖乳桿菌FJAT-13807。從發(fā)酵時間上看，有的乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸總量的峰值非常突出，如短乳桿菌FJAT-43776，脂肪酸總量24 h達(dá)到峰值，占整個發(fā)酵過程脂肪酸總量累計值的61.85%；而其他乳酸菌峰值不突出，在幾個發(fā)酵時間上分布較為均勻。

2.2.3 乳酸菌發(fā)酵過程活菌數(shù)與發(fā)酵液脂肪酸的相互關(guān)系

如圖4所示，不同乳酸菌其脂肪酸代謝能力不同，如植物乳桿菌FJAT-13737活菌數(shù)與脂肪酸呈指數(shù)關(guān)系，方程為y＝0.010 7e2×10－6x（R2=0.788 8），隨著脂肪酸總量的變化，活菌數(shù)呈指數(shù)增長（圖4A）；德氏乳桿菌FJAT-43773（圖4B）、副干酪乳桿菌FJAT-13741（圖4C）、鼠李糖乳桿菌FJAT-13807（圖4D）活菌數(shù)與脂肪酸呈拋物線關(guān)系，隨著脂肪酸總量的變化，這些乳酸菌的活菌數(shù)呈拋物線增長；短乳桿菌FJAT-43776活菌數(shù)與脂肪酸呈線性關(guān)系，方程為y=2×10－5x－25.475（R2=0.979 2），隨著脂肪酸總量的變化，活菌數(shù)呈線性增長（圖4E）；嗜酸乳桿菌FJAT-13772活菌數(shù)與脂肪酸呈指數(shù)關(guān)系，隨著脂肪酸總量的變化，該菌活菌數(shù)呈指數(shù)增長（圖4G）；而有的乳酸菌生長能力與脂肪酸代謝無函數(shù)關(guān)系，如發(fā)酵乳桿菌FJAT-13771和嗜熱鏈球菌FJAT-43774（圖4F、H）。

圖4 乳酸菌發(fā)酵過程活菌數(shù)與脂肪酸的相互關(guān)系Fig.4 Correlation between the number of viable bacteria and the total amount of fatty acids in the fermentation broth of lactic acid bacteria

2.3 乳酸菌發(fā)酵階段發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊分析

微生物種性遺傳通過物質(zhì)代謝差異性構(gòu)建出不同的物質(zhì)組生態(tài)位寬度，形成互補(bǔ)的生存條件，構(gòu)建兩個物種共存空間[28-29]。生態(tài)位重疊是生態(tài)位計測過程中的一個重要指標(biāo)，是兩個或多個物種或種群在適應(yīng)環(huán)境和利用資源的實際幅度或潛在能力方面所表現(xiàn)出的共同性或相似性[30-31]。特定脂肪酸組作為乳酸菌一個特征物質(zhì)組，在相同生存條件下構(gòu)建出不同的發(fā)酵液脂肪酸組生態(tài)位寬度和重疊度，探究利用生存資源情況。

2.3.1 發(fā)酵初期（1 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊

如表2所示，菌株的生態(tài)位寬度范圍在5.182 3～5.965 8之間，菌株間的生態(tài)位重疊值范圍在0.956 4～0.998 4之間；表明發(fā)酵初期（1 h）乳酸菌處于生長適應(yīng)期，活菌數(shù)較低，營養(yǎng)條件的容量較大，菌株生長和脂肪酸代謝的限制性較小，菌株具有相近的生態(tài)位寬度，對脂肪酸資源的利用具有同質(zhì)性。已有研究表明，資源生態(tài)位重疊可以促進(jìn)細(xì)菌群落代謝的穩(wěn)定性[4]。發(fā)酵初期不同乳酸菌之間的重疊值大于0.95，重疊性很高，表明了乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸代謝特性相似，能很好地適應(yīng)相應(yīng)的培養(yǎng)條件，菌株間的共培養(yǎng)性較強(qiáng)。

表2 發(fā)酵初期（1 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊Table 2 Fatty acid niche width and overlap of lactic acid bacteria at the initial stage of fermentation (1 h)

2.3.2 發(fā)酵中期（24 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊

如表3所示，菌株的生態(tài)位寬度發(fā)生了較大的分化，范圍在3.477 8～7.283 8之間。發(fā)酵中期為乳酸菌對數(shù)生長期，脂肪酸生態(tài)位寬度的分化影響著乳酸菌生長方式，可將這種分化分為3 個類型。

表3 發(fā)酵中期（24 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊Table 3 Fatty acid niche width and overlap of lactic acid bacteria at the middle stage of fermentation (24 h)

第1個類型：隨著發(fā)酵進(jìn)程發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度增加，德氏乳桿菌FJAT-43773從發(fā)酵初期到發(fā)酵中期，脂肪酸生態(tài)位寬度由5.35增加到7.28，這表明乳酸菌對脂肪酸資源利用包容性增加，利用效率下降，處于指數(shù)增長期的乳酸菌降低了生長速率，按線性方式增長，此時德氏乳桿菌FJAT-43773的活菌數(shù)增長方式為為線性增長，方程為y=9.306x－13.4（R2=0.921）（圖5A）。

第2個類型：發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度減小，鼠李糖乳桿菌FJAT-13807（從5.53下降至3.48）、發(fā)酵乳桿菌FJAT-13771（從5.55下降至4.71）、嗜酸乳桿菌FJAT-13772（從5.23下降至4.47），表明乳酸菌對脂肪酸資源利用限制性增加，利用效率靠近發(fā)酵中期有所提高，處于指數(shù)增長期的乳酸菌前期生長速率低，靠近發(fā)酵中期提高，乳酸菌活菌數(shù)按拋物線方程增長，如鼠李糖乳桿菌FJAT-13807活菌數(shù)方程為y=1.442 9x2+14.483x－12.94（R2=0.925 1），發(fā)酵乳桿菌FJAT-13771方程為y=7.792 9x2－13.447x+4.2（R2=0.995 6），嗜酸乳桿菌FJAT-13772方程為y=2.804 3x2－12.2x+11.66（R2=0.879 4）（圖5B～D）。

第3個類型：生態(tài)位寬度維持水平，如植物乳桿菌FJAT-13737、短乳桿菌FJAT-43776、副干酪乳桿菌FJAT-13741、嗜熱鏈球菌FJAT-43774，表明對脂肪酸資源利用持續(xù)性增加，利用效率保持，處于對數(shù)生長期的乳酸菌活菌數(shù)按指數(shù)方程生長，植物乳桿菌FJAT-13737方程為：y=0.008 2e1.4262x（R2=0.887 8），短乳桿菌FJAT-43776方程為：y=0.075 9e1.5715x（R2=0.915 9），副干酪乳桿菌FJAT-13741方程為：y=0.009e1.6375x（R2=0.801 1），嗜熱鏈球菌FJAT-43774方程為：y=0.020 3e1.3352x（R2=0.784 9）（圖5E～H）。

圖5 發(fā)酵中期（24 h）不同脂肪酸生態(tài)位寬度分化類型的乳酸菌活菌數(shù)模型Fig.5 Models depicting the viable cell count of lactic acid bacteria with different fatty acid niche widths at the middle stage of fermentation (24 h)

研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌生態(tài)位寬度的大小與其生態(tài)位重疊無相關(guān)關(guān)系。發(fā)酵中期（24 h），菌株間的脂肪酸生態(tài)位重疊聚類分析如圖6所示，聚為3 組。第1組為低重疊值組，包含了10 對乳酸菌，重疊值范圍為0.069 7～0.284 1，表明它們之間的生態(tài)位幾乎不重疊，各自利用脂肪酸資源空間差異性較大，推測它們之間進(jìn)行共培養(yǎng)協(xié)同性較差，該結(jié)果與前期研究發(fā)現(xiàn)的鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌共培養(yǎng)特性較差相吻合。第2組中重疊值組，包含了9 對乳酸菌，重疊值范圍為0.567 2～0.643 5，表明它們之間的生態(tài)位存在部分重疊，各自對利用脂肪酸資源空間存在關(guān)聯(lián)，影響不大。第3組高重疊值組，包含了9 對乳酸菌，重疊值范圍為0.840 6～0.999 0，表明它們之間的生態(tài)位幾乎完全重疊，各菌株影響到對方脂肪酸資源空間利用的競爭。

圖6 發(fā)酵中期（24 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位重疊聚類分析（可變類平均法）Fig.6 Cluster analysis of fatty acid niche overlap in pairs of lactic acid bacteria at the middle fermentation stage (24 h)

2.3.3 發(fā)酵后期（48 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊

如表4所示，菌株的生態(tài)位寬度發(fā)生了較大的分化，范圍為4.158 5～7.176 6。發(fā)酵后期為乳酸菌生長處于消亡期，生態(tài)位寬度的分化影響著乳酸菌生長方式；可將這種分化分為3 個類型。

表4 發(fā)酵后期（48 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊Table 4 Fatty acid niche width and overlap of lactic acid bacteria at the final stage of fermentation (48 h)

第1個類型生態(tài)位寬度較窄，生態(tài)位寬度在4左右；生態(tài)位寬度變窄表明，乳酸菌對脂肪酸資源利用限制性增加，利用效率下降，處于穩(wěn)定消亡期的乳酸菌生長呈指數(shù)函數(shù)下降，如植物乳桿菌FJAT-13737（4.16），其方程為：y=71.989e－0.522x（R2=0.747 3）（圖7A）。

第2個類型生態(tài)位寬度較寬，生態(tài)位寬度在6～7之間；生態(tài)位寬度加寬表明，乳酸菌對脂肪酸資源利用包容性增加，利用效率提高，從發(fā)酵中期到發(fā)酵后期乳酸菌生長經(jīng)歷了一個峰值和谷底，活菌數(shù)按一元三次函數(shù)變化，如德氏乳桿菌FJAT-43773（生態(tài)位寬度5.950 4）、副干酪乳桿菌FJAT-13741（6.421 1）、鼠李糖乳桿菌FJAT-13807（7.176 6）的方程分別為：y=0.833 3x3－9.928 6x2+38.238x+2.4（R2=0.629 5）、y=3.833 3x3－34.929x2+94.238x－40.2（R2=0.786）、y=6.75x3－63.464x2+163.79x－12（R2=0.964）（圖7B～D）。

第3個類型生態(tài)位寬度中等，生態(tài)位寬度在5左右；生態(tài)位寬度中等表明，乳酸菌對脂肪酸資源利用持續(xù)性增加，利用效率持續(xù)，乳酸菌從發(fā)酵中期過度到發(fā)酵后期，活菌數(shù)從高處迅速下降，如短乳桿菌FJAT-43776（生態(tài)位寬度4.966 6）、發(fā)酵乳桿菌FJAT-13771（4.976 7）、嗜酸乳桿菌FJAT-13772（5.168 0）、嗜熱鏈球菌FJAT-43774（5.059 1），冪指數(shù)方程分別為：y=149.5x－5.982（R2=0.913 3）、y=97.461x－1.221（R2=0.747 9）、y=20.743x－1.493（R2=0.929 7）、y=10.768x－3.491（R2=0.966 2）（圖7E～H）。

圖7 發(fā)酵后期（48 h）不同脂肪酸生態(tài)位寬度分化類型的乳酸菌活菌數(shù)模型Fig.7 Models depicting the viable cell count of lactic acid bacteria with different fatty acid niche widths at the final stage of fermentation (48 h)

發(fā)酵后期（48 h），乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度的大小與其生態(tài)位重疊無相關(guān)關(guān)系。菌株間的脂肪酸生態(tài)位重疊值范圍在0.508 8～0.999 3，可將之分為2 組，第1組中重疊值組，包含了15 對乳酸菌，重疊值范圍0.508 8～0.615 4（圖8），生態(tài)位重疊的平均值0.559 8，表明它們之間的生態(tài)位存在部分重疊，各自對利用脂肪酸資源空間存在關(guān)聯(lián)，影響不大。第2組高重疊值組，范圍0.969 9～0.990 3，包含了13 對乳酸菌（圖8），生態(tài)位重疊的平均值0.990 3，表明它們之間的生態(tài)位存在完全重疊，各菌株影響到對方脂肪酸資源空間利用的競爭。

圖8 發(fā)酵后期（48 h）乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位重疊聚類分析（可變類平均法）Fig.8 Cluster analysis of fatty acid niche overlap in pairs of lactic acid bacteria at the final fermentation stage (48 h)

3 結(jié) 論

本研究測定了8 種乳酸菌發(fā)酵過程的發(fā)酵液完整脂肪酸組，共檢測到脂肪酸生物標(biāo)記91 條，其中支鏈脂肪酸種類最豐富（70 條），不可培養(yǎng)脂肪酸種類最少（9 條）。不同乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸總量差異顯著，但脂肪酸總量與乳酸菌生長能力無直接相關(guān)性。乳酸菌發(fā)酵過程生態(tài)位的分化對乳酸菌生長模式的影響不同，發(fā)酵初期（1 h），不同乳酸菌的脂肪酸生態(tài)位寬度差異不顯著，菌株間脂肪酸生態(tài)位重疊程度較高，活菌數(shù)較低，環(huán)境容量較大，生態(tài)位寬度與重疊無相關(guān)性。發(fā)酵中期（24 h），乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度和重疊發(fā)生了較大的分化，影響處于對數(shù)生長期的乳酸菌生長模式，生態(tài)位寬度增加，乳酸菌生長速度下降，活菌數(shù)呈線性方程增長；生態(tài)位寬度減少，乳酸菌生長速度增加，活菌數(shù)呈拋物線方程增長；生態(tài)位寬度維持，乳酸菌生長速度維持原有方式，此時處于對數(shù)增長期，活菌數(shù)按指數(shù)方程增長。發(fā)酵后期（48 h），乳酸菌發(fā)酵液脂肪酸生態(tài)位寬度與重疊也有類似分化，此時乳酸菌處于穩(wěn)定消亡期，生態(tài)位寬度較寬，乳酸菌生長能力下降，活菌數(shù)呈指數(shù)方程下降；生態(tài)位寬度較窄，乳酸菌生長能力增強(qiáng)，活菌數(shù)呈一元三次方程變動；生態(tài)位寬度維持，乳酸菌維持原有的規(guī)律，活菌數(shù)呈冪指數(shù)下降。乳酸菌發(fā)酵過程脂肪酸組生態(tài)位異質(zhì)性為其生長特性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。