酶抑制法快速檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑多殘留

劉鳳銀，李 瀅，王小鵬，吳曉丹，陳鳳燕，梁 岳，袁學(xué)文，穆洪濤,

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東 廣州 510303；2.廣東省生物工程研究所，廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東 廣州 510316）

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑是一類小分子化合物，其能夠與β-內(nèi)酰胺類抗生素競爭性結(jié)合耐藥菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶，使酶失活，恢復(fù)細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性[1-4]。目前常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有舒巴坦、克拉維酸、他唑巴坦和阿維巴坦，結(jié)構(gòu)見圖1。食品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑主要有兩方面來源，一是內(nèi)源性殘留，在動物生產(chǎn)中，為提高抗生素的抗菌作用，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑常與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用，但由于不規(guī)范用藥甚至濫用問題，導(dǎo)致奶及動物組織中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑殘留[5-7]；二是外源性添加，一些不法商家為掩蓋奶中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留，加入β-內(nèi)酰胺酶作為“解抗劑”，同時又加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑以躲避β-內(nèi)酰胺酶的檢測，導(dǎo)致奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑殘留；增大了奶及肉類的安全風(fēng)險，對消費(fèi)者身體健康造成威脅[8-9]。鑒于此，國內(nèi)外均對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑制定了最高殘留限量（maximum residue limit，MRL），歐洲醫(yī)藥評價局與我國農(nóng)業(yè)部均規(guī)定牛、羊奶中克拉維酸的MRL為200 μg/kg[10-11]。

圖1 4 種常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four common β-lactamase inhibitors

目前對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法主要有儀器分析法和酶抑制法。前者主要有高效液相色譜法[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]和毛細(xì)管電泳法[16]等，儀器分析法優(yōu)點(diǎn)在于高準(zhǔn)確性、高靈敏度，缺點(diǎn)在于設(shè)備昂貴、檢測成本高，對從業(yè)人員的專業(yè)技術(shù)要求較高，無法滿足快速、簡便、大樣本量篩查的檢測需求。酶抑制法是基于待測物能夠不可逆地抑制相應(yīng)酶的活性，根據(jù)酶促反應(yīng)強(qiáng)度的變化測定待測物的含量，具有靈敏度高、快速簡便、成本低廉及易于基層推廣的優(yōu)點(diǎn)[17-18]。Uri等[19]首次基于克拉維酸能夠不可逆地抑制β-內(nèi)酰胺酶活性的原理，以肺炎克雷白氏菌的發(fā)酵液作為酶原，頭孢硝噻吩作為顯色底物，建立了一種酶抑制法檢測克拉維酸。后續(xù)關(guān)于酶抑制法檢測β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的少數(shù)研究報道，均基于類似原理。如戴西達(dá)等[20]將上述原理應(yīng)用于微生物樣品中克拉維酸的檢測，篩選克拉維酸高產(chǎn)菌株。王斯文等[21]基于該原理，建立了一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑高通量篩選模型，用于新藥研發(fā)中藥物的篩選。也有研究[22]將該原理應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域，檢測牛奶樣品中的舒巴坦殘留，但報道未提供其他幾種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的交叉反應(yīng)率數(shù)據(jù)，同時檢測靈敏度較差，對舒巴坦的檢出限為5 mg/L。目前，我國僅規(guī)定了動物源食品中克拉維酸殘留量檢測的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法）[23]，尚未出臺其他3 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。因此，開發(fā)準(zhǔn)確靈敏、快速簡便、便于基層推廣的檢測方法，豐富食品中β速內(nèi)酰胺酶抑制劑殘留的監(jiān)督檢測手段，十分必要。

β-內(nèi)酰胺酶能夠催化頭孢硝噻吩（淡黃色，λmax=390 nm）水解生成紅棕色化合物（在本實(shí)驗(yàn)體系中，其λmax為488 nm）；β-內(nèi)酰胺酶抑制劑能夠與β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合，導(dǎo)致其酶活性喪失，抑制上述顯色反應(yīng)；在一定濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的顯色強(qiáng)度與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑濃度呈負(fù)相關(guān)。本研究基于該原理，建立一種酶抑制法，可實(shí)現(xiàn)牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑多殘留快速高通量篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品購于本地超市。

舒巴坦（純度98%） 北京百靈威科技有限公司；克拉維酸鉀（純度95%）、他唑巴坦（純度＞98%）北京伊諾凱科技有限公司；阿維巴坦鈉（純度99%）上海博湖生物科技有限公司；β-內(nèi)酰胺酶（TEM-1，酶活力3×106U/mL）、頭孢硝噻吩、二甲基亞砜（≥99.9%）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；96 孔微孔板 廈門怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技有限公司；PHS-3C精密酸度計(jì) 上海雷磁儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LC-20ADXR液相色譜儀（配AB SCIEX API4000三重四極桿質(zhì)譜儀） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)步驟

配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），用于β-內(nèi)酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的溶解與稀釋；頭孢硝噻吩用少量二甲基亞砜溶解后，用PBS稀釋至合適濃度。以96 孔微孔板為反應(yīng)容器，實(shí)驗(yàn)步驟如下：向β-內(nèi)酰胺酶溶液中加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻進(jìn)行孵育，再加入頭孢硝噻吩溶液進(jìn)行水解顯色，采用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度A488nm。上述β-內(nèi)酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢硝噻吩溶液的體積比為1∶8∶1。實(shí)驗(yàn)全程避光反應(yīng)。

1.3.2 4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度初步評價

以0.2 mol/L pH 7.0 PBS分別配制β-內(nèi)酰胺酶溶液（3×104U/mL），頭孢硝噻吩溶液（0.5 mg/mL），舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.3.1節(jié)方法，37 ℃水浴孵育30 min、顯色1 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別以β-內(nèi)酰胺酶抑制劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y，繪制其抑制曲線，計(jì)算半抑制濃度IC50，以此初步評價方法對4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度。選擇IC50最大的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑進(jìn)行后續(xù)工作條件優(yōu)化。

1.3.3 最佳工作條件的優(yōu)化

采用單因素試驗(yàn)，考察緩沖體系pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、反應(yīng)溫度（4、25、37、50 ℃）、β-內(nèi)酰胺酶活力（3.33×103、1.0×104、3.0×104、9.0×104、2.7×105U/mL）、頭孢硝噻吩質(zhì)量濃度（0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）、孵育時間（15、30、60 min）和顯色時間（20、40、60、80 min）等理化因素對檢測靈敏度的影響。繪制抑制曲線，從曲線擬合度、最大吸光度Amax、IC50和Amax/IC50等方面綜合評價抑制曲線的性能。

1.3.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.00 g牛奶樣品于離心管中，加入2 mL乙腈渦旋混勻，4 000 r/min離心5 min；取出上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2 mL正己烷，劇烈渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，收集下層清液，重復(fù)2 次；將下層清液40 ℃水浴下用氮?dú)獯蹈?。加? mL PBS超聲復(fù)溶，過0.22 μm水相濾膜，用于酶抑制法檢測；加入2 mL 10%乙腈水超聲復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，用于LC-MS/MS法檢測。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與基質(zhì)效應(yīng)的消除

取不含有舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦、阿維巴坦鈉和β-內(nèi)酰胺酶的空白牛奶樣品（β-內(nèi)酰胺酶抑制劑含量經(jīng)LC-MS/MS法測定；β-內(nèi)酰胺酶殘留量按照NY/T 3313—2018《生牛乳中β-內(nèi)酰胺酶的測定》中第二法膠體金快速試紙條法測定），按照1.3.4節(jié)步驟，進(jìn)行樣品前處理，制備空白基質(zhì)溶液。用PBS和空白基質(zhì)溶液分別溶解稀釋4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列濃度梯度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述確定的最佳工作條件下進(jìn)行酶抑制法實(shí)驗(yàn)，分別繪制其溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算出4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢出限（IC10）、IC50和線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）。

1.3.6 牛奶中殘留β-內(nèi)酰胺酶對檢測結(jié)果的影響

向空白基質(zhì)溶液中加入β-內(nèi)酰胺酶，使其終濃度為0、40、200 U/mL，分別以其作為稀釋液，配制一系列濃度梯度的舒巴坦基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別繪制在基質(zhì)溶液含有不同β-內(nèi)酰胺酶濃度水平下的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。考察牛奶中殘留β-內(nèi)酰胺酶對檢測結(jié)果的影響。

1.3.7 添加回收率的測定

向空白牛奶樣品中，分別添加舒巴坦（200、1 000、10 000 μg/kg）、克拉維酸鉀（100、200、300 μg/kg）、他唑巴坦（20、50、100 μg/kg）、阿維巴坦鈉（20、50、100 μg/kg），經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。酶抑制法采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率。同時采用LC-MS/MS法進(jìn)行測定，比對測定結(jié)果。

1.3.8 LC-MS/MS法確證

色譜條件：色譜柱為Kinetex XB-C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.4 mL/min；流動相及梯度：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，0～1.0 min，95% A，5% B；1.0～1.5 min，95%～5% A，5%～95% B；1.5～4.0 min，5% A，95% B；4.0～4.1 min，5%～95% A，95%～5% B；4.1～5 min，95% A，5% B。

質(zhì)譜條件：電離源為大氣壓電噴霧離子源負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓4.50 kV；源溫度550 ℃；脫溶劑氣溫度550 ℃；脫溶劑氣流量500 μL/min；錐孔反吹氣流量200 μL/min；電子倍增管電壓2 200 V；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；特征離子見表1。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Main MS/MS parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、表格繪制；采用Origin 2019繪制抑制曲線；采用ChemDraw pro 18繪制化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度初步評價

4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均能抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，但抑制能力不同[24-25]，使得方法對其檢測靈敏度亦不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在初始條件下，舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的IC50分別為1 190.72、107.34、17.06 μg/kg和22.17 μg/kg，其中他唑巴坦的靈敏度最高，舒巴坦的靈敏度最低。為實(shí)現(xiàn)對4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的同時檢測，盡可能地提高對舒巴坦的檢測靈敏度，實(shí)驗(yàn)選擇舒巴坦作為基準(zhǔn)分析物，進(jìn)行后續(xù)工作條件優(yōu)化。

2.2 最佳工作條件的優(yōu)化

選擇曲線擬合度好、Amax較大、IC50較小、Amax/IC50較大的反應(yīng)條件作為最佳工作條件。得最佳工作條件如下：緩沖體系pH 7.0、反應(yīng)溫度37 ℃、β-內(nèi)酰胺酶活力3.0×104U/mL、頭孢硝噻吩質(zhì)量濃度1 mg/mL、孵育時間30 min、顯色時間1 h。

2.3 樣品前處理方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)旨在建立牛奶中4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的多殘留檢測方法，為使在實(shí)際樣品檢測中對4 種目標(biāo)分析物均能獲得較好的回收率，故從4 種化合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、實(shí)際樣品的基質(zhì)成分出發(fā)，篩選合適的樣品前處理方法。牛奶中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，對其進(jìn)行除蛋白、除脂處理是檢測前的必要步驟。常用的蛋白質(zhì)沉淀劑有強(qiáng)酸沉淀劑，如高氯酸、三氯乙酸、濃硝酸等，但舒巴坦、克拉維酸和他唑巴坦均含有一個四元環(huán)結(jié)構(gòu)，在強(qiáng)酸條件下易分解[26]，實(shí)驗(yàn)測試了即使使用有效沉淀牛奶蛋白的最低質(zhì)量濃度三氯乙酸（在牛奶體系中約18 g/L）進(jìn)行處理，克拉維酸的回收率亦不足60%；亞鐵氫化鉀和乙酸鋅無機(jī)沉淀劑，鄭小嚴(yán)等[27]研究發(fā)現(xiàn)該沉淀劑雖能較好地沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)，但會造成舒巴坦、克拉維酸和他唑巴坦的嚴(yán)重?fù)p失；對有機(jī)溶劑沉淀劑如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等，實(shí)驗(yàn)比對了有效沉淀牛奶蛋白所需的4 種有機(jī)溶劑的量，其與牛奶的體積比分別為乙腈1∶1、甲醇4∶1、乙醇3∶1、丙酮1.5∶1，乙腈的使用量最小，故實(shí)驗(yàn)采用乙腈作蛋白沉淀劑。克拉維酸的熱穩(wěn)定差，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氮吹時水浴溫度超過50 ℃，克拉維酸便有明顯降解，故牛奶樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白、正己烷除脂后，40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，用相?yīng)的溶劑復(fù)溶備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)成分引起的基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重干擾了待測物定量分析的準(zhǔn)確性，尤其是針對有復(fù)雜成分組成的食品樣品中的待測物檢測，僅依賴簡單的前處理手段，難以很好地消除基質(zhì)的干擾。目前已有多種消除基質(zhì)效應(yīng)的方法報道，其中基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法采用不含目標(biāo)待測物的空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立校正曲線，可同等程度地補(bǔ)償樣品基質(zhì)對待測物的檢測干擾，是一種有效的、國際上常用的基質(zhì)效應(yīng)消除方法[28-29]。

分別繪制4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。計(jì)算不同標(biāo)準(zhǔn)曲線下4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的IC50、檢出限和線性范圍，見表2。雖采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算時，4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均取得了更低的IC50和檢出限，但從圖2可知，在目前的樣品前處理?xiàng)l件下，仍存在一定的基質(zhì)干擾，尤其在中低濃度范圍內(nèi)，有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，以溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行實(shí)際樣品檢測時，會影響定量的準(zhǔn)確性。故實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以消除基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，使結(jié)果更可靠。

圖2 4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線及基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Solvent standard curves and matrix-matched standard curves for four β-lactamase inhibitors

表2 不同標(biāo)準(zhǔn)曲線下4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢出限、IC50及線性范圍比較Table 2 Comparison of detection limit, IC50 and linear range for four β-lactamase inhibitors with different standard curves μg/kg

以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，方法對牛奶中舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別為42.88、10.20、1.68 μg/kg和3.48 μg/kg。以克拉維酸的MRL（200 μg/kg）為參考，本方法滿足牛奶中4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑殘留的檢測靈敏度需求。

2.5 牛奶中殘留β-內(nèi)酰胺酶對檢測結(jié)果的影響

基于β-內(nèi)酰胺酶催化頭孢硝噻吩水解顯色的原理，通過測定顯色的強(qiáng)度，間接測定牛奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的含量。若牛奶本身殘留β-內(nèi)酰胺酶過多，可能會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。研究表明，目前牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的殘留量大多在4 U/mL以下[30]。實(shí)驗(yàn)向空白基質(zhì)溶液中加入了其10、50 倍濃度水平即β-內(nèi)酰胺酶含量為40、200 U/mL，考察其對檢測結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。與不含β-內(nèi)酰胺酶的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，當(dāng)含量為40 U/mL時，其曲線與前者基本完全重疊，說明該濃度水平下的β-內(nèi)酰胺酶對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響；當(dāng)含量為200 U/mL時，在舒巴坦中低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其曲線偏離前者明顯，吸光度較大，易導(dǎo)致假陽性。綜上，β-內(nèi)酰胺酶殘留量不超過40 U/mL時，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性無影響?？紤]到在樣品前處理過程中，會導(dǎo)致牛奶中殘留的部分β-內(nèi)酰胺酶被去除或失活，方法對牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶的實(shí)際耐受水平應(yīng)該更高。

圖3 牛奶中殘留β-內(nèi)酰胺酶對檢測結(jié)果的影響Fig.3 Effect of β-lactamase residue levels in milk on results of detection

2.6 添加回收率實(shí)驗(yàn)

以被測化合物定量離子信噪比為3，確定LC-MS/MS法對舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別0.53、4.45、0.28 μg/kg和0.28 μg/kg；4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑在10～500 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，均呈良好的線性關(guān)系。目前我國農(nóng)業(yè)部僅制定了奶中克拉維酸的MRL。針對制定有MRL的克拉維酸鉀，實(shí)驗(yàn)參照EN 2002/657/EC標(biāo)準(zhǔn)[31]，以0.5、1.0、1.5 倍MRL三個水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)；對于未制定MRL的舒巴坦、他唑巴坦和阿維巴坦鈉3 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，在其酶抑制法（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線）的線性范圍內(nèi)選取高、中、低3 個水平進(jìn)行添加。4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的添加量均處于酶抑制法的線性范圍內(nèi)，且高于LC-MS/MS法的線性范圍下限；當(dāng)添加量高于LC-MS/MS法的線性范圍上限時，對樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其濃度處于線性范圍內(nèi)。對空白牛奶樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，比對酶抑制法和LC-MS/MS法的測定結(jié)果。從表3可知，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量時，酶抑制法具有良好的回收率和重復(fù)性，平均回收率在80.43%～115.87%之間，變異系數(shù)在1.63%～10.14%之間。LC-MS/MS法的平均回收率在80.08%～104.35%之間，變異系數(shù)在0.60%～5.32%之間。兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性見圖4，相關(guān)系數(shù)R2為0.982，酶抑制法與LC-MS/MS法測定結(jié)果一致性良好，說明本實(shí)驗(yàn)建立的酶抑制法具有良好的準(zhǔn)確性。

表3 酶抑制法、LC-MS/MS法對4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的加標(biāo)回收率測定結(jié)果（n=3）Table 3 Recoveries of four β-lactamase inhibitors from spiked milk samples by the enzyme inhibition method and LC-MS/MS (n= 3)

圖4 酶抑制法和LC-MS/MS測定結(jié)果相關(guān)性曲線Fig.4 Correlation of LC-MS/MS results with enzyme inhibition results

3 結(jié) 論

4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑除阿維巴坦之外，均含有四元內(nèi)酰胺環(huán)，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下易降解。以牛奶為篩查對象，為使酶抑制法對每種目標(biāo)分析物均能獲得較為理想的添加回收率，實(shí)驗(yàn)對比了多種樣品前處理方法，發(fā)現(xiàn)以乙腈沉淀蛋白、正己烷除脂、氮?dú)獯蹈珊笥玫攘縋BS復(fù)溶，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法消除基質(zhì)干擾，4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑均獲得了良好的添加回收率。

對于牛奶中可能殘留的β-內(nèi)酰胺酶，推測其可能會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[32]，并給出了去除牛奶中微量β-內(nèi)酰胺酶的方法，即采用強(qiáng)酸（鹽酸和硝酸的混合液）沉淀蛋白后，再用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至中性?？紤]到克拉維酸的酸敏感性，該樣品前處理方式并不適用于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的多殘留檢測。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在該酶抑制法體系下，牛奶中少量的β-內(nèi)酰胺酶殘留（不超過40 U/mL），不會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)基于酶抑制法原理，建立了一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑多殘留快速檢測方法，最佳工作條件為測定波長488 nm、緩沖體系pH 7.0、反應(yīng)溫度37 ℃、β-內(nèi)酰胺酶活力3.0×104U/mL、頭孢硝噻吩質(zhì)量濃度1 mg/mL、孵育時間30 min和顯色時間1 h。在牛奶樣品中，對舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別為42.88、10.20、1.68 μg/kg和3.48 μg/kg，滿足牛奶樣品的檢測靈敏度要求。相較于目前報道的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑單殘留快速檢測方法，如戴西達(dá)等[20]建立的克拉維酸單殘留檢測法、沙芳芳等[7]建立的舒巴坦ELISA法，該酶抑制法能夠在一次分析實(shí)驗(yàn)中，同時篩查4 種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，在分析通量、成本和實(shí)用性方面，具有突出優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)豐富了β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的檢測方法，對牛奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑殘留標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的建立提供參考。