張 彪，黃 娜，張萬利，王 碩，生 威,

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學醫(yī)學院，天津 300072）

酪胺又稱對羥基苯乙胺，是酪氨酸在酪氨酸脫羧酶作用下產(chǎn)生的一元胺，作為常見的小分子生物胺，主要存在于肉及其制品、水產(chǎn)品以及發(fā)酵制品中[1-3]。研究表明適量的酪胺可促進新陳代謝，維持正常生理特征，但過量的酪胺可引起偏頭痛、心力衰竭、血壓飆升、哮喘和蕁麻疹等健康問題[4-6]，因此酪胺含量的檢測有可能成為評價肉類水產(chǎn)品新鮮度和發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量的一個新指標[7-9]。

目前國內(nèi)外酪胺的檢測方法主要為薄層色譜法[10]、離子交換色譜法[11]、毛細管電泳法[12]、高效液相色譜法[13-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16]、電化學傳感器法[17]和酶聯(lián)免疫吸附劑測定法[18]，上述儀器方法可以靈敏、準確地檢測酪胺的含量，但樣品的前處理復雜，衍生化物質(zhì)穩(wěn)定性差[19]，設備成本高昂，且需專業(yè)技術(shù)人才操作，而電化學傳感器法同儀器檢測方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差[20]。基于抗原-抗體特異性識別的酪胺免疫分析方法，主要為傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，但該方法穩(wěn)定性較差、檢測時間較長、靈敏度低[18,21]。因此有必要開發(fā)樣品前處理簡單、操作便捷、檢測快速、靈敏度高、方法重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好的酪胺檢測新方法。

本實驗用純化酪胺多克隆抗體標記上轉(zhuǎn)換納米材料（upconversion nanoparticles，UCNPs）制備信號探針，酪胺包被原偶聯(lián)磁性聚苯乙烯微球制備捕獲探針，在最優(yōu)的實驗條件下孵育捕獲探針與酪胺間接地相競結(jié)合信號探針表面抗體的反應30 min后，利用磁力架將信號探針與捕獲探針的免疫復合物分離，多次清洗后，檢測免疫復合物的熒光強度，結(jié)果表明，熒光強度的差值與酪胺質(zhì)量濃度呈負相關(guān)。本實驗運用磁分離技術(shù)建立酪胺的熒光免疫分析方法，節(jié)約檢測時間、提高檢測效率，可實現(xiàn)肉及其制品、發(fā)酵產(chǎn)品以及海產(chǎn)品中酪胺快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、培根、金鯧魚、奶酪、米酒、醬油 市購。

三氯乙酸（純度為99.0%） 天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；酪胺、組胺、苯乙胺、色胺、章魚胺、5-羥色胺、精胺、亞精胺、酪氨酸、四水合乙酸釔、乙酸銩、四水合乙酸鐿、聚苯烯酸、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二甘醇、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid，MES）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]卡二亞胺（N-ethyl-N’-(3-diethylaminopropyl)-carbodiimide，EDC）、聚丙烯酸（polyacrylic acid，PAA，分析純） 美國Sigma-Aldrich公司；氟化銨、氫氧化鈉、十八烯酸（純度均不小于90%）、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，HEPES）、乙腈、乙酸銨（均為色譜純） 天津國藥集團化學試劑有限公司；磁性聚苯乙烯微球（magnetic polystyrene microspheres，MPMs） 天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。所有分離用有機溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F-2500熒光分光光度計（配有980 nm外部激發(fā)器）日本Hitachi公司；高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器） 日本島津公司；純水儀 美國Millipore公司；WONDASIL C18SUPERB色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm） 島津技邇（上海）商貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaYF4Yb,Tm UCNPs與信號探針制備

參考Sheng Wei等[22]合成UCNPs的方法并進行修改以制備UCNPs。取38.0 mg四水合乙酸鐿、304.3 mg四水合乙酸釔、3.5 mg乙酸銩溶解于17.5 mL十八烯酸和6.0 mL油酸混合物中。攪拌加熱到160 ℃，維持30 min，再降溫到40 ℃，逐滴加入含148.0 mg氟化銨和100.0 mg氫氧化鈉的10 mL甲醇維持30 min，溫度升至90 ℃并維持約40 min除去甲醇，再升至110 ℃并維持約30 min除去溶液中的O2，加熱到310 ℃并維持60 min，冷卻至室溫后離心，乙醇清洗后在60 ℃烘干得油溶性UCNPs。油溶性UCNPs經(jīng)配體交換法獲得水溶性UCNPs。配體交換法需稱取1.5 g PAA，加入到含30 mL二甘醇三頸燒瓶中，在氬氣的保護下，加熱反應溶液使燒瓶內(nèi)溫度升高至110 ℃，并保持劇烈攪拌反應1 h；稱取90.0 mg油溶性UCNPs溶解于6.0 mL甲苯中，將此混合溶液快速加入到反應液中，同時在110 ℃保持1 h后，繼續(xù)升高反應體系的溫度至240 ℃保持1 h，反應完畢后自然冷卻至室溫，離心收集沉淀產(chǎn)物。隨后用超純水離心洗滌沉淀物3 次后，放置干燥箱中干燥，得到水溶性聚丙烯酸上轉(zhuǎn)換材料（polyacrylic acid-upconversion nanoparticles，PAA-UCNPs）。

制備酪胺的免疫原需將20.0 mg BSA溶解于4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.4），將含4.2 mg酪胺的100 μL DMSO溶液逐滴加入上述溶液，再逐漸加入13 μL體積分數(shù)25%的戊二醛溶液，4 ℃攪拌反應過夜。反應溶液經(jīng)透析袋于4 ℃透析3 d，獲得酪胺免疫原，放置－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

抗體在本實驗的前期制備[23]。選2 只雄性新西蘭大耳白兔（8～10 周齡、體質(zhì)量2.5～3 kg），首次免疫采用背部多點皮下注射和腿部肌肉注射免疫，采用多點皮下注射免疫的方式重復加強免疫5 次。初次免疫時，每只兔子的免疫劑量為1 mg免疫原（以BSA的量計算）；加強免疫時，每只兔子的免疫劑量為0.5 mg免疫原（以BSA的量計算）。從第3次免疫開始，每次免疫后隔1 周進行耳緣靜脈取血以測定抗體性能。最后一次免疫7 d后，股動脈取全血，4 ℃冰箱靜置過夜，4 ℃、10 000 r/min離心10 min獲得抗體血清，純化后分裝－20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

參考Sheng Wei等[22]制備信號探針的方法并進行修改。將5.0 mg水溶性UCNPs、5.0 mg NHS和10.0 mg EDC溶解于2.0 mL MES溶液（0.01 mol/L、pH 5.5），30 ℃攪拌3 h活化UCNPs的羧基位點，以4 ℃、4 000 r/min離心10 min，沉淀超純水清洗3 次除去多余的NHS和EDC?；罨蟮腢CNPs復溶到2.0 mL HEPES溶液（0.01 mol/L、pH 7.2），加入適量體積的酪胺抗體進行偶聯(lián)。于4 ℃、4 000 r/min離心10 min獲得UCNPs與抗體的偶聯(lián)復合物，再用HEPES溶液清洗3 次后，復溶到2.0 mL質(zhì)量分數(shù)10% BSAHEPES溶液，于30 ℃持續(xù)反應1 h以封閉UCNPs表面多余位點。于4 ℃、4 000 r/min離心10 min清洗后復溶，獲得1.0 mL UCNPs與酪胺抗體的偶聯(lián)復合物，即信號探針。

1.3.2 酪胺包被原與捕獲探針制備

參照Sheng Wei等[23]方法制得酪胺包被原。20.0 mg OVA溶解于4.0 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），將含3.7 mg酪胺的100 μL DMSO溶液逐滴加入上述溶液，再逐漸加入13 μL體積分數(shù)25%的戊二醛溶液，4 ℃攪拌反應過夜。反應溶液經(jīng)透析袋于4 ℃透析3 d，獲得酪胺包被原，置于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

5.0 mg MPMs溶解于1.0 mL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4），加入10.0 mg EDC和5.0 mg NHS，在30 ℃活化表面羧基1 h。用PBS清洗3 次以除去經(jīng)外部磁力活化后MPMs的雜質(zhì)。MPMs用1.0 mL PBS復溶，并加入一定量制備好的酪胺包被原，且在30 ℃孵育4 h。經(jīng)外部磁力分離獲得酪胺包被原與MPMs的復合物，再復溶到體積分數(shù)為20%的BSA-PBS以封閉MPMs表面未反應的羧基，靜置1 h。經(jīng)外部磁力分離清洗后獲得酪胺的感應探針，復溶到5.0 mL PBS備用。

1.3.3 熒光免疫分析方法

基于酪胺與感應探針上包被原互相間接競爭結(jié)合信號探針表面的抗體后，磁分離感應探針與信號探針的偶聯(lián)物，用分光光度計測定偶聯(lián)物中UCNPs的熒光強度，通過公式計算酪胺在不同質(zhì)量濃度下的熒光強度差，并以酪胺質(zhì)量濃度為橫坐標，熒光強度差值為縱坐標，建立酪胺的熒光免疫分析方法標準曲線。配制50 μL質(zhì)量濃度分別為0.00、0.02、0.05、0.10、1.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、500.00 μg/L的酪胺標準品溶液，依次加入50 μL感應探針和50 μL信號探針于2.0 mL離心管，加入PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）并定容到400 μL，搖床240 r/min勻速轉(zhuǎn)動反應30 min。磁分離后棄上清液，清洗感應探針與信號探針的偶聯(lián)物，復溶后通過下式計算熒光強度差值：

ΔI=I0－I1

式中：ΔI為熒光強度差值；I0為體系無酪胺的熒光強度；I1為不同質(zhì)量濃度酪胺對應的熒光強度。

1.3.4 熒光免疫分析方法的特異性驗證

為考察本方法的特異性，檢測酪氨酸、亞精胺、亞精胺、組胺、組氨酸、章魚胺、色胺、苯乙胺和5-羥色胺等生物胺和酪胺結(jié)構(gòu)類似物，通過比較不同待測物產(chǎn)生的熒光強度差值與酪胺產(chǎn)生的熒光強度差值，評價該方法的特異性。

1.3.5 樣品處理

高效液相色譜檢測樣品的處理方法參考GB/T 5009.208—2016《食品中生物胺含量的測定》[24]，熒光免疫分析處理樣品參考Sheng Wei等[23]方法。5.0 g含豬肉、培根、金鯧魚和奶酪的樣本與20.0 mL體積分數(shù)3%的三氯乙酸溶液混合，于4 ℃、600 r/min高速渦旋5 min后，以4 ℃、10 000 r/min離心10 min。上清液加入20.0 mL正己烷后，高速渦流5 min去除脂肪。收集下層溶液，1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性后，用PBS溶液適當稀釋待測。醬油、米酒調(diào)至中性后，用PBS稀釋待測。

1.3.6 色譜條件

色譜柱：C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm）；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；流動相A：體積分數(shù)0.1%的乙酸-乙酸銨溶液；流動相B：乙腈。梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 UCNPs表征

油溶性與水溶性UCNPs的透射電鏡、粒徑分布、傅里葉紅外光譜與熒光光譜表征結(jié)果如圖1所示。圖1a和圖1b表明，油溶性與水溶性UCNPs均呈球形且分布均勻。油溶性UCNPs的粒徑分布約在23.5～32.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為28.3 nm；水溶性UCNPs的粒徑分布在24.5～33.5 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為29.6 nm（圖1c、d）。如圖1e所示，3 437、3 450 cm－1均對應羥基的伸縮振動，油溶性UCNPs的傅里葉紅外光譜在2 928 cm－1出現(xiàn)峰值對應甲基的伸縮振動，水溶性UCNPs的傅里葉紅外光譜在1 730 cm－1出現(xiàn)峰值，對應羰基在2 928 cm－1峰值消失，分析原因為油溶性UCNPs經(jīng)配體交換后，水溶性UCNPs表面成功修飾羧基[25-26]。圖1f表明，所合成的UCNPs在980 nm激發(fā)波長下，能發(fā)射出單一的483 nm熒光，其可作為熒光檢測信號。

圖1 UCNPs材料表征Fig.1 Characterization of UCNPs

2.2 信號探針與感應探針制備條件的優(yōu)化

信號探針與感應探針的制備條件直接影響熒光免疫分析方法的靈敏度和準確性[26]。如圖2a所示，固定50 μL質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL已活化的水溶性UCNPs，當抗體添加量小于12 μg，抗體添加量增加時，水溶性UCNPs表面偶聯(lián)抗體量也逐漸增加；當抗體添加量大于等于12 μg，偶聯(lián)量基本不變，但偶聯(lián)率呈現(xiàn)整體下降的趨勢，因此選擇添加12 μg酪胺抗體制備信號探針，固定50 μL 5.0 mg/mL已活化的MPMs，并添加不同質(zhì)量的包被原，結(jié)果如圖2b所示，因此選擇添加70 μg酪胺包被原制備感應探針。

圖2 抗體（a）、包被原（b）添加量的優(yōu)化Fig.2 Optimization of preparation conditions of antibody (a) and coated antigen (b) mass added

2.3 信號探針添加量與孵育時間的優(yōu)化

信號探針與感應探針的比例直接影響熒光免疫分析方法的靈敏度和準確性，而孵育時間決定了該方法的檢測速度[27]。如圖3a所示，當固定感應探針的添加體積為40 μL，且信號探針的添加量增加時，反應體系的熒光強度也隨之增加；信號探針添加體積為70 μL時，熒光強度達到最大；信號探針添加體積大于70 μL，熒光強度增加不顯著，因此選擇70 μL為信號探針的添加量。如圖3b所示，熒光強度隨著孵育時間延長而增大，后趨于穩(wěn)定；孵育時間為30 min時，熒光強度達到最大值；孵育時間大于30 min時，熒光強度基本不變，為了能夠快速檢測，孵育時間應為30 min。

圖3 信號探針添加量（a）與孵育時間（b）的優(yōu)化Fig.3 Optimization of signal probe dosage (a) and incubation time (b)

2.4 熒光免疫分析方法的建立

利用建立的熒光免疫分析方法檢測酪胺，結(jié)果如圖4所示，未添加酪胺檢測時，體系的熒光強度為I0，不同質(zhì)量濃度的酪胺對應不同的熒光強度I，隨著酪胺質(zhì)量濃度增加，檢測體系的熒光強度逐漸降低。以酪胺的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，熒光強度差值為縱坐標，建立酪胺的熒光免疫分析方法標準曲線。標準曲線的線性方程為y=382.818 9lgx+649.831 8（R2=0.998 6），檢測限按照3 倍信噪比原則計算[28]，建立的方法檢測線性范圍為0.1～100.0 μg/L，方法檢測限為0.05 μg/L。

圖4 不同酪胺質(zhì)量濃度的熒光強度Fig.4 Fluorescence intensity of tyramine at different concentrations

2.5 熒光免疫分析方法的特異性

為評價熒光免疫分析方法的特異性，對質(zhì)量濃度10 μg/L的酪胺及其同質(zhì)量濃度的結(jié)構(gòu)類似物、同類物進行檢測，并根據(jù)空白熒光強度計算相應的熒光強度差值[29]，結(jié)果如圖5所示，酪胺熒光差值響應高，亞精胺、精胺、組胺、酪氨酸、組氨酸、章魚胺、色胺、苯乙胺、5-羥色胺等類似物的響應值從200逐漸降低至0，經(jīng)熒光免疫分析方法檢測，熒光差值響應低，說明建立的熒光免疫分析方法能特異性檢測酪胺，其他生物胺和酪胺的結(jié)構(gòu)類似物均不會影響酪胺的檢測。

圖5 熒光免疫分析方法特異性分析Fig.5 Specificity analysis of fluorescence immunoassay

2.6 實際樣品檢測

為了進一步評價酪胺的熒光免疫分析方法檢測的準確性和實際應用性[28-29]，實驗進行樣品檢測和酪胺加標回收實驗，結(jié)果如表2所示，未添加的樣品中均檢測出酪胺，而且熒光免疫分析方法的檢測結(jié)果與高效液相色譜法的檢測結(jié)果有很好的一致性。酪胺熒光免疫分析方法中，酪胺的添加回收率在86.44%～101.62%范圍內(nèi)，且變異系數(shù)小于10%；高效液相色譜法的酪胺添加回收率在87.40%～104.86%范圍內(nèi)，且變異系數(shù)小于10%。以上2 種方法的檢測結(jié)果在酪胺的本底值與添加量的2 種條件下均呈現(xiàn)一致性，因此本實驗建立的熒光免疫分析方法能夠應用于肉及其制品、水產(chǎn)品以及發(fā)酵制品中酪胺的檢測。

表2 高效液相色譜法和熒光免疫分析方法檢測實際樣品中酪胺的結(jié)果（n= 3）Table 2 Comparison of results of HPLC and fluorescence immunoassay for tyramine in food samples (n= 3)

3 結(jié) 論

本實驗合成了在980 nm激發(fā)波長下具有483 nm特征發(fā)射峰的UCNPs作為信號標記物，利用抗原-抗體的特異性識別作用和磁性微球的快速磁分離作用，建立快速、高特異性檢測食品中酪胺的熒光免疫分析方法，同時與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法相比，靈敏度更高、操作更簡單；與高效液相色譜方法相比，樣品前處理步驟不需要衍生化步驟，因此縮短了檢測時間。真實樣品中酪胺含量的測定結(jié)果與液相色譜檢測結(jié)果具有很好的一致性，說明本方法具有很好的實際應用性。本實驗建立的熒光免疫分析方法可作為肉及肉制品、發(fā)酵產(chǎn)品以及水產(chǎn)品中酪胺的檢測工具。由于UCNPs的優(yōu)良光學特性，其作為信號標記物可運用于食品中小分子危害物的高靈敏檢測方法中，因此有良好的應用前景。