余艷玲 羅輝 羅洪林 馮鵬霏 肖蕊 張永德 林勇 宋漫玲 潘傳燕

摘要：【目的】原核表達斑馬魚（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受體B（PTPRB）并制備多克隆抗體，為研究斑馬魚PTPRB基因功能及血管發(fā)育相關(guān)信號傳導(dǎo)通路打下基礎(chǔ)。【方法】采用無縫克隆技術(shù)將斑馬魚PTPRB基因插入原核表達載體pET-B2m構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌B21感受態(tài)細胞后采用IPTG進行誘導(dǎo)表達，然后以誘導(dǎo)表達的融合蛋白免疫大耳兔制備多克隆抗體，并采用Western blotting和ELISA檢測多克隆抗體的特異性及免疫效價?！窘Y(jié)果】斑馬魚PTPRB蛋白親水性均值為-0.490，屬于親水性蛋白，且具有較豐富的潛在抗原表位位點，分布均勻，無典型的跨膜區(qū)。將斑馬魚PTPRB基因插入原核表達載體pET-B2m成功構(gòu)建獲得重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB，轉(zhuǎn)化B21感受態(tài)細胞后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，即獲得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵體形式存在;以純化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔，其血清抗體效價為1∶2048000，說明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，獲得較高效價的PTPRB多克隆抗體。Western blotting檢測結(jié)果顯示，PTPRB多克隆抗體具良好抗原特異性。采用Protein A/G親和層析柱對制備獲得的PTPRB多克隆抗體進行親和層析純化，可獲得高純度的多克隆抗體，純化后的PTPRB多克隆抗體濃度在10 mg/mL以上?！窘Y(jié)論】構(gòu)建的斑馬魚PTPRB基因原核表達載體能高效表達具備良好免疫原性的融合蛋白PTPRB，以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可獲得高效價、高特異性的PTPRB多克隆抗體，為研究斑馬魚PTPRB蛋白功能提供有利工具，也為揭示PTPRB在魚類血管發(fā)育中的作用機制提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 斑馬魚;PTPRB;原核表達;多克隆抗體

中圖分類號： S965.819? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-1090-08

Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Danio rerio angiogenesis related factor PTPRB

FENG Peng-fei1， XIAO Rui1， ZHANG Yong-de1， LIN Yong1， SONG Man-ling1，

PAN Chuan-yan1， YU Yan-ling1， LUO Hui2， LUO Hong-lin1*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，? Nanning 530021， China; 2School of Animal Science， Southwest University， Chongqing? 402460， China）

Abstract：【Objective】 Prokaryotic expression of zebrafish（Danio rerio） protein tyrosine phosphatase receptor B （PTPRB） and preparation of polyclonal antibodies were conducted to lay the foundation for studying the function of zebrafish PTPRB gene and signal transduction pathways related to vascular development. 【Method】The zebrafish PTPRB gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-B2m to construct the recombinant expression plasmid by seamless cloning technology. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli B21 competent cells， and induced to express by IPTG. Then the polyclonal antibody was prepared by immunizing rabbits with the induced fusion protein. The specificity and immune titer of the polyclonal antibody were detected by Western blotting and ELISA. 【Result】The average hydrophilicity of zebrafish PTPRB protein was -0.490， which belonged to hydrophilic protein. It had abundant potential epitopes， distributed evenly and had no typical transmembrane region. The zebrafish PTPRB gene was inserted into the prokaryotic expression vector pET-B2m， and the recombinant expression plasmid pET-B2-PTPRB was successfully constructed. The recombinant expression plasmid was transformed into B21 competent cells and induced by IPTG to express a 35.0 kD fusion protein. The fusion protein PTPRB mainly existed in the form of inclusion bodies; the purified fusion protein PTPRB was used to immunize big-eared rabbits， and the serum antibody titer was 1∶2048000， indicating that the fusion protein PTPRB could effectively stimulate the big-eared rabbits to produce a stronger immune response and obtain PTPRB polyclonal antibody with high titer. Western blotting results showed that PTPRB polyclonal antibody has good antigen specificity. High purity polyclonal antibody against PTPRB was obtained by using protein A/G affinity chromatography column. The concentration of the purified PTPRB polyclonal antibody was above 10 mg/mL. 【Conclusion】The constructed zebrafish PTPRB gene prokaryotic expression vector can efficiently express the fusion protein PTPRB with good immunogenicity. High titer and high specificity polyclonal antibody against PTPRB can be obtained by immunizing big-eared rabbits with the fusion protein PTPRB， which provides a tool for studying the function of zebrafish PTPRB protein and a way to reveal the mechanism of PTPRB in fish vascular development.

Key words： Danio rerio; PTPRB; prokaryotic expression; polyclonal antibody

Foundation item：Guangxi Innovation Driven Development Special Project（Guike AA17204080-3，Guike AA182 42031-2）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（17-A-01-02， 19-A-01-05）

0 引言

【研究意義】蛋白酪氨酸磷酸酶受體B（Polyclonal antibody to protein tyrosine phosphatase receptor type B，PTPRB）是一種高度混雜R3受體蛋白酪氨酸磷酸酶，可脫去磷酸多個受體酪氨酸激酶（Barr et al.，2009）。PTPRB也是一種具有內(nèi)皮細胞黏附連接（AJs）的跨膜蛋白，在內(nèi)皮細胞中特異表達（Nawroth et al.，2002;Emig et al.，2010;Pond et al.，2013）。PTPRB由2215個氨基酸殘基組成，擁有18個結(jié)構(gòu)域，包括1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Ando and Yamamoto，2009）;其功能是對血管內(nèi)皮細胞鈣黏連蛋白（VE-cadherin）及其血管內(nèi)皮細胞（Vascular endothelial cell，EC）發(fā)揮黏著作用（Dominguez et al.，2007）。由于過去有關(guān)PTPRB的研究主要集中在血管形成方面，因此也被稱為VE-PTP（Vascular endothelial-protein tyrosine phosphatase）（翁星月，2020）。在脊椎動物的發(fā)育過程中，PTPRB是血管分支形態(tài)發(fā)生的負調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)FGFR下游的信號而發(fā)揮作用。因此，研究PTPRB蛋白的原核表達，對進一步揭示動物機體的血管發(fā)育機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明，PTPRB可通過抑制GEF-H1與血管內(nèi)皮細胞VE-cadherin穩(wěn)定連接及限制內(nèi)皮細胞通透性，進而限制AJs的RhoA信號傳導(dǎo)和降低VE-cadherin內(nèi)吞率，最終維持血管穩(wěn)態(tài)（Mellberg et al.，2009;Thomson et al.，2019）。許玲俐（2012）研究發(fā)現(xiàn)，PTPRB表達量可影響小鼠視網(wǎng)膜血管分布的均勻程度?；糇雍桑?017）研究證實，阿托伐他?。ˋtorvastatin）通過促進轉(zhuǎn)錄因子SP1表達，以及與PTPRB基因啟動子的結(jié)合，而促進PTPRB基因表達，進而降低內(nèi)皮細胞間通透性。Delgado-Bellido等（2020）通過自噬調(diào)節(jié)VE-cadherin蛋白的降解，證實PTPRB在血管生成擬態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。斑馬魚（Danio rerio）屬于熱帶淡水硬骨魚，因其生長繁殖周期短，且具有與人類高度相似的基因組等特點，常作為重要模式動物應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域研究（何秋霞等，2009）。斑馬魚PTPRB是一種特異的血管內(nèi)皮蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs），其基因表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與小鼠PTPRB非常相似，說明PTPRB在斑馬魚中也具有PTPs活性（楊少麗等，2009;孫桂金等，2010;鐘敏，2011;Souma et al.，2018）。Nicoli等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，通過激活斑馬魚的MAPK/PIK3信號通路，可有效上調(diào)PTPRB和KLF2基因表達，而達到促進血管重構(gòu)的效果。劉源（2018）通過研究藏茵陳水提物影響斑馬魚血管完整性的信號通路機制，發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎新生血管的生成與PTPRB基因下調(diào)表達有關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】大量研究表明，PTPRB在動物體內(nèi)起到維持血管穩(wěn)態(tài)的作用，但至今鮮見有關(guān)斑馬魚PTPRB抗體的報道，很大程度上限制了對斑馬魚PTPRB基因功能的深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建斑馬魚PTPRB原核表達載體，采用IPTG誘導(dǎo)得到融合PTPRB蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后免疫大耳兔，以期獲得具有良好抗原特性的PTPRB多克隆抗體，為進一步研究斑馬魚PTPRB基因功能及血管發(fā)育相關(guān)信號傳導(dǎo)通路打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

原核表達載體pET-B2m和大腸桿菌（Escherichia coli）B21感受態(tài)細胞購自武漢金開瑞生物工程有限公司;完全弗式佐劑和不完全弗氏佐劑購自美國Sigma公司;Taq DNA聚合酶、蛋白Marker及內(nèi)切酶BamH I和Sal I購自Fermentas公司;PVDF膜購自ThermoFisher公司;IPTG購自生工生物工程（上海）股份有限公司;In-Fusion? HD Cloning Kit購自Clontech公司;Ni-NTA親和層析柱購自GE Healthcare公司;質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司。

1. 2 PTPRB蛋白抗原表位預(yù)測及親/疏水性分析

采用DNASTAR 7.1（https：//www.dnastar.com/software/）預(yù)測斑馬魚PTPRB蛋白的抗原指數(shù)，利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protscale/）在線預(yù)測其親/疏水性，并以TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測斑馬魚PTPRB蛋白跨膜區(qū)。

1. 3 目的基因PCR擴增

根據(jù)斑馬魚PTPRB基因編碼區(qū)（CDS）序列（GenBank登錄號NM_001316727.1），采用Primer 5.0設(shè)計含有載體序列的擴增引物Pf-PTPREB-F（5'-tttc aaggtccactgggttctcggactatgATCGACAGGCCCCCTGT CCCACCAG-3'）和Pf-PTPREB-R（5'-tcagtggtggtggtgg tggtgctcgagtgcggccttaGCCGCTTCGTGGTGCTGA-3'）（小寫字母為載體序列擴增引物）。PCR反應(yīng)體系100.0 μL：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1.0 μL，10×Taq Buffer 10.0 μL，dNTP（10 mmol/L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各5.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補足至100.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，進行28個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。

1. 4 重組原核表達載體構(gòu)建

對斑馬魚PTPRB基因序列進行大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，以BamH I和Sal I對原核表達載體pET-B2m進行雙酶切處理，依靠載體與目的基因序列的同源堿基互補配對成環(huán)，將斑馬魚PTPRB基因亞克隆至原核表達載體pET-B2m上。篩選陽性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果采用MAFFT ver.7（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/server/）進行多序列比對分析，以確定所插入的基因是否正確。

1. 5 融合蛋白誘導(dǎo)表達

以構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB轉(zhuǎn)化B21感受態(tài)細胞，挑取單克隆，接入3.0 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁（OD600=0.6），加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h，然后取1.0 mL菌液離心收集沉淀，以100.0 μL的1% SDS重懸菌液后混勻，100 ℃處理10 min，取上清液進行15% SDS-PAGE電泳檢測分析。

1. 6 融合蛋白包涵體純化

以5.0 mL PBS重懸菌液沉淀，并加入蛋白酶抑制劑PMSF，低溫超聲破碎后5000×g離心15 min，收集沉淀，再以8 mol/L尿素緩沖液溶解沉淀，16000×g離心30 min，取上清液，按Ni-NTA親和層析柱操作指南進行融合蛋白純化，并采用SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的純化效果。

1. 7 多克隆抗體制備與鑒定

將純化后達到抗體制備要求的融合蛋白與等量弗氏佐劑充分乳化，每隔2周免疫大耳兔1次，共免疫5次。首次免疫使用完全弗氏佐劑進行乳化，其他4次則使用不完全弗氏佐劑進行乳化，完成第5次免疫2周后檢測免疫抗體效價，待抗體表達穩(wěn)定后采集大耳兔血清，采用Protein A/G親和層析柱進行純化。

1. 8 抗體效價ELISA測定

參照張永德等（2018）的方法，以融合蛋白為抗原，按100.0 μL/孔加入到96孔板中進行抗原包被，再以含2%卵清蛋白（OVA）的BSA室溫封閉30 min，PBST洗3次;大耳兔血清按二倍稀釋法將1∶2000的原始濃度稀釋至1∶8192000，以不同稀釋比例的單克隆抗體為一抗，以空白血清為陰性對照，每孔加入100.0 μL，37 ℃孵育1 h后，PBST洗滌3次;每孔加入100.0 ?L IgG，37 ℃恒溫孵育45 min，PBST液洗5次;每孔加入100.0 μL TMB顯色液，充分顯色后加入50.0 μL終止反應(yīng)液（2 mol/L H2SO4）。計算試驗樣品孔的P/N，P/N≥2時為陽性（李彥等，2011），陰性對照為無抗體檢測孔。

1. 9 Western blotting檢測分析

純化融合蛋白PTPRB經(jīng)SDS-PAGE電泳分檢測離后，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上;PBST洗膜3次，封閉液浸泡過夜。加入融合蛋白PTPRB多克隆抗體（大耳兔血清），37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次;加入抗兔-HRP二抗，37 ℃恒溫孵育1 h，經(jīng)PBST洗滌3次后浸入顯影液中顯色，再浸入定影液中定影，晾干，拍照分析。

1. 10 抗體純化

采用Protein A/G親和層析柱，將收集的抗血清與2×PBS平衡的Protein A抗體純化柱結(jié)合4 h，上樣混合后，用10倍柱體積的Binding Buffer清洗平衡柱子2次，再以0.1 mol/L檸檬酸進行洗脫，收集洗脫液;洗脫液經(jīng)處理制樣后進行SDS-PAGE電泳檢測， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2. 1 斑馬魚PTPRB蛋白親/疏水性及跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果

斑馬魚PTPRB蛋白由182個氨基酸殘基組成，氨基酸序列中以親水性氨基酸比例較高，其親水性均值為-0.490，親水性氨基酸區(qū)段位置分別位于第1～10位、第12～17位、第35～41位、第47～77位、第88～100位、第115～140位、第150～158位和第175～182位（圖1），即氨基酸序列親水性良好。丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）和纈氨酸（Val）等疏水性氨基酸分別占編碼氨基酸總數(shù)的7.00%、7.78%、1.00%、9.22%、7.11%、8.11%和9.67%。TMHMM 2.0預(yù)測結(jié)果顯示，斑馬魚PTPRB蛋白不存在跨膜區(qū)，其182個氨基酸殘基均位于細胞表面，易于表達純化。

2. 2 斑馬魚PTPRB蛋白抗原性預(yù)測結(jié)果

采用DNAStar的Protean模塊對斑馬魚PTPRB蛋白的抗原指數(shù)進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑馬魚PTPRB蛋白序列存在較多的抗原表位位點，且部分位點集中形成抗原性較高的區(qū)段，主要區(qū)段分別位于第2～8位、第12～17位、第28～31位、第35～37位、第38～41位、第51～99位、第116～130位、第131～143位、第147～165位和第175～182位（圖2）。這10個區(qū)段具有較強的親水性位點，因此利用斑馬魚PTPRB蛋白制備多克隆抗體具有較高的可行性。

2. 3 斑馬魚PTPRB重組原核表達載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

以Pf-PTPREB-F和Pf-PTPREB-R為引物、重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB為模板，經(jīng)PCR擴增與1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示在950 bp附近出現(xiàn)特異性的目的條帶（圖3）。經(jīng)序列測定及比對分析，確定斑馬魚PTPRB基因已正確插入原核表達載體pET-B2m，即重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB構(gòu)建成功。

2. 4 融合蛋白PTPRB誘導(dǎo)表達結(jié)果

以重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB轉(zhuǎn)化B21感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、離心沉淀及SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達菌株在35.0 kD處出現(xiàn)1條明顯的表達條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株在此處未見明顯的表達條帶。

2. 5 重組蛋白PTPRB表達形式的鑒定結(jié)果

重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB轉(zhuǎn)化菌株大量誘導(dǎo)表達后，經(jīng)離心破碎，收集沉淀和上清液進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示在35.0 kD處均獲得1條特異性的蛋白條帶（圖5），但沉淀中的融合蛋白含量明顯高于上清液。

2. 6 融合蛋白PTPRB的提取與純化結(jié)果

重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB轉(zhuǎn)化菌株誘導(dǎo)表達的融合蛋白PTPRB經(jīng)超聲波破碎，即獲得PTPRB包涵體，純化后進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果獲得1條明顯的特異性條帶（圖6），其大小與預(yù)期的目的蛋白（35.5 kD）一致。

2. 7 融合蛋白PTPRB血清抗體的免疫效價

采用ELISA檢測純化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔的抗體效價，結(jié)果（圖7）顯示其血清抗體效價為1∶2048000，說明原核表達的融合蛋白PTPRB可誘導(dǎo)大耳兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，且能獲得較高的抗體效價。

2. 8 Western blotting檢測結(jié)果

采用Western blotting進一步驗證純化融合蛋白PTPRB的特異性，結(jié)果如圖8所示，10和25 ng純化融合蛋白PTPRB在48.9 kD附近的相應(yīng)位置均出現(xiàn)1條清晰的特異性條帶，其中25 ng純化融合蛋白PTPRB出現(xiàn)的條帶更清晰，而免疫前陰性血清（對照組）未出現(xiàn)任何條帶，說明通過免疫大耳兔制備獲得的PTPRB多克隆抗體具有較高的特異性。

2. 9 抗體純化結(jié)果

采用Protein A/G親和層析柱對制備獲得的PTPRB多克隆抗體進行親和層析純化，可獲得高純度的多克隆抗體。純化后的PTPRB多克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果獲得2條特異性條帶（圖9），其大小分別為45.0 kD（帶紋清晰）和25.0 kD（帶紋相對較弱），與PTPRB多克隆抗體的重鏈和輕鏈的大小相吻合。純化后的PTPRB多克隆抗體濃度在10 mg/mL以上，純化效果良好。

3 討論

PTPRB可調(diào)節(jié)血管重構(gòu)及血管生成，由1個具有c端磷酸化位點的細胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域、1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個具有多纖維連接結(jié)構(gòu)域的細胞外結(jié)構(gòu)域組成（Muramatsu et al.，2017）。PTPRB在動物胚胎血管發(fā)育中的作用及功能已得到證實（Carota et al.，2019），可通過增強VE-cadherin介導(dǎo)的黏附作用，從而影響血管系統(tǒng)發(fā)育（孟梅，2015）。PTPRB在細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酪氨酸的磷酸化水平，而參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的生長與遷移（Delgado-Bellido et al.，2020）。有研究表明，在藥物干預(yù)作用下斑馬魚胚胎PTPRB基因表達下調(diào)，致使VE-cadherin無法去磷酸化，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的黏附和連接結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮細胞連接異常而抑制斑馬魚新生血管生成（Chen et al.，2018）。此外，PTPRB抗體可通過平衡Tie-2活性和內(nèi)皮細胞增殖，控制新生小鼠的血管發(fā)育（Thomson et al.，2019）。雖然已有研究證實PTPRB在斑馬魚中具有酪氨酸磷酸酶活性（楊少麗等，2009），但其作用機制尚未明確。為此，本研究通過制備兔抗魚PTPRB多克隆抗體，以期為揭示PTPRB在調(diào)節(jié)魚類血管重構(gòu)及血管生成過程中的作用機制提供技術(shù)支撐。斑馬魚PTPRB蛋白親/疏水性及跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示，其親水性均值為-0.490，屬于親水性蛋白，且具有較豐富的潛在抗原表位位點，分布均勻，無典型的跨膜區(qū)，說明對斑馬魚PTPRB進行原核表達與多克隆抗體制備具有可行性。

本研究采用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB，并轉(zhuǎn)化B21感受態(tài)細胞進行原核表達，獲得的融合蛋白分子量約35.0 kD，與理論分子量37.0 kD存在一定差異，可能與斑馬魚PTPRB蛋白在大腸桿菌中的修飾過程及His-Tag的加入有關(guān)。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果表明，在重組表達質(zhì)粒pET-B2-PTPRB轉(zhuǎn)化菌株的上清液和沉淀中均能檢測到約35.0 kD的特異性條帶，但沉淀中的融合蛋白含量明顯高于上清液，說明IPTG誘導(dǎo)表達獲得的融合蛋白PTPRB可能是以可溶性和不溶性的形式同時存在，但主要是不溶性包涵體蛋白。包涵體蛋白是一般基因原核表達常見的形式，是大腸桿菌作為重組菌不可避免的特質(zhì)（Mitraki et al.，1991）。大量研究表明，外源基因在大腸桿菌中高水平表達時，若新生肽鏈的聚集速率超過蛋白正常折疊速率就會在菌體內(nèi)形成不溶且無活性的包涵體（井明艷和孫建義，2004;Rinas et al.，2017）。蛋白表達量也是影響包涵體形成的因素之一，蛋白表達量與包涵體的形成成正比，當(dāng)?shù)鞍妆磉_量高于細胞總蛋白的2%即導(dǎo)致包涵體形成。包涵體的形成提示通過大腸桿菌B21感受態(tài)細胞能高效表達斑馬魚PTPRB蛋白。此外，包涵體的聚集不會使酶或蛋白失活（Novo et al.，2010），在轉(zhuǎn)基因、組織工程及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，且無需溶解和重新折疊（柴燕濤等，2016;Tian et al.，2016）。本研究也發(fā)現(xiàn)，采用具有包涵體的融合蛋白PTPRB免疫大耳兔，可獲得具有較高效價的PTPRB多克隆抗體，即包涵體的存在對抗體制備未產(chǎn)生明顯影響。

PTPRB是在斑馬魚中新發(fā)現(xiàn)的受體分子，目前尚無抗PTPRB的商業(yè)化特異抗體，因此亟待研發(fā)出斑馬魚PTPRB多克隆抗體，為進一步研究PTPRB基因的生物功能提供技術(shù)支持。本研究以純化后的融合蛋白PTPRB為抗原對大耳兔進行免疫刺激，其血清抗體效價為1∶2048000，說明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，獲得較高效價的PTPRB多克隆抗體。該結(jié)論不僅為斑馬魚PTPRB蛋白功能研究提供有利工具，也為深入探究PTPRB在魚類血管發(fā)育中的作用機制提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

構(gòu)建的斑馬魚PTPRB基因原核表達載體能高效表達具備良好免疫原性的融合蛋白PTPRB，以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可獲得高效價、高特異性的PTPRB多克隆抗體，為研究斑馬魚PTPRB蛋白功能提供有利工具，也為揭示PTPRB在魚類血管發(fā)育中的作用機制提供技術(shù)支持。

參考文獻：

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）