陶志華，劉偉锜，喬娜，謝姝穎，陳泳琪，曹楚珩，何妍慶，梁綺琦，鐘家本

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣州 510006)

1 概述

梅香魚(又名酶香魚)是廣東等沿海高溫地區(qū)的一種鹽漬自然發(fā)酵魚制品，在廣東沿海地帶作為配菜佳肴，頗具盛名。梅香魚在鹽漬過程中通過內(nèi)源酶的自溶和微生物的發(fā)酵作用，產(chǎn)生特殊的梅香氣味[1]。魚在發(fā)酵過程會(huì)伴隨大量微生物的存在，微生物代謝作用會(huì)使蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量游離氨基酸、多肽和有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)，賦予腌制魚特殊的風(fēng)味。而氨基酸又可能會(huì)在微生物的進(jìn)一步作用下產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物，生物胺就是其中微生物代謝的有害代謝物質(zhì)，是在適宜條件下，魚肉中大量游離氨基酸在微生物的氨基酸脫羧酶作用下產(chǎn)生的，攝取過量的胺類會(huì)引起食物中毒現(xiàn)象，尤其是組胺，攝入過量的組胺會(huì)引起頭疼、惡心、嘔吐、痙攣，嚴(yán)重的會(huì)危及生命，其次是酪胺，尸胺和腐胺會(huì)加重組胺中毒癥狀[2-6]。而且生物胺能與咸魚中常存化合物亞硝酸鈉生成亞硝基胺類化合物，引起癌變[7]，魚類生物胺嚴(yán)重影響人體健康，從而產(chǎn)生嚴(yán)重貿(mào)易壁壘。美國(guó)FDA設(shè)限進(jìn)口水產(chǎn)品組胺不得超過 50 mg/L, 酪胺≤100 mg/L，總生物胺含量不得超過1000 mg/L；歐盟規(guī)定鯖科魚制品組胺含量不能超過100 mg/L[8]；我國(guó)制定的GB 2733-2005中對(duì)組胺限量的規(guī)定：鮐魚不能大于100 mg/100 g，其他魚類則不能大于30 mg/100 g[9]。鯖科魚因含有大量的游離氨基酸易引起生物胺的累積，而鯖科魚加工的梅香魚制品的生物胺相關(guān)調(diào)查分析研究知之甚少，梅香魚可作為佐餐配料，是直接加工食用的咸魚，為廣東沿海的熱銷魚制品，所以展開梅香魚生物胺含量的調(diào)查，為梅香魚的食品安全控制提供了非常重要的參考數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 材料

市售梅香魚20塊(梅香魚個(gè)體大，超市切塊封裝賣，市場(chǎng)切賣)。

2.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙酸銨、三氯乙酸：廣州華鑫科技有限公司；組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、苯乙胺標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、二甲氨基萘磺酰氯：Sigma公司。

2.3 儀器

攪拌器、離心機(jī)、恒溫干燥箱、真空抽濾器；高效液相色譜儀(HPLC) 日本島津公司。

2.4 試劑的配制

5%三氯乙酸溶液：稱得25 g三氯乙酸，用水溶解，然后用容量瓶定容并稀釋至500 mL。

乙酸銨溶液(0.1 mol/L)：稱取3.584 g乙酸銨，用水稀釋定容至500 mL，備用。

飽和碳酸氫鈉溶液：稱取15 g碳酸氫鈉，溶于100 mL水中，置于試劑瓶中備用。

鹽酸(1 mol/L)：量取8.6 mL濃鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

二甲氨基萘磺酰氯(10 mg/mL)：稱取1 g二甲氨基萘磺酰氯，溶于100 mL丙酮中，混勻置于棕色瓶中，避光保存。

氫氧化鈉溶液(1 mol/L)：精準(zhǔn)稱得4 g氫氧化鈉，然后倒入100 mL水完全溶解，備用。

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品(1000 mg/L)：分別配制組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、酪胺、精胺、亞精胺的標(biāo)準(zhǔn)品，分別稱取0.01 g，依次倒入8個(gè)10 mL小燒杯內(nèi)，加入濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶液對(duì)這8種樣品進(jìn)行溶解，以0.1 mol/L鹽酸為定容液體到需求的刻度，充分?jǐn)嚢柚辆鶆颍渲瞥蓾舛葹?000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)備用溶液，放入-20 ℃的冰箱中保存。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將配制好的8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品分別用0.1 mol/L的鹽酸稀釋至10.0，15.0，25.0，50.0，100.0 mg/L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后取0.5 mL，加入50 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，振蕩混合均勻，置于40 ℃培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)45 min，中間振蕩2次，取出，加入0.1 mL 25%氨水暗處?kù)o置30 min，再置于60 ℃水浴15 min除去丙酮，冷卻至室溫后用乙腈定容至5 mL，振蕩混勻，再用0.22 μL有機(jī)膜過濾后上機(jī)待測(cè)，得到峰面積，將其作為縱坐標(biāo)，而濃度作為橫坐標(biāo)，獲取8種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的線性關(guān)系。

2.5.2 樣品生物胺的提取及衍生

精準(zhǔn)稱得魚肉樣品約5.0 g，對(duì)其進(jìn)行剪碎處理，然后放入100 mL錐形瓶中，倒入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，充分振蕩提取1 h，使用3600 r/min的離心設(shè)備離心10 min，然后對(duì)上部的清液進(jìn)行提取，重復(fù)進(jìn)行2次，然后以5%三氯乙酸為定容液體到25 mL，最后借助0.45 μL的有機(jī)膜進(jìn)行過濾處理。

樣品的衍生：精準(zhǔn)量得樣品0.5 mL，各自倒入50 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、1.5 mL處于飽和狀態(tài)的碳酸氫鈉溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，充分振蕩混合后，使其達(dá)到均勻，然后放到40 ℃的水浴鍋內(nèi)在無光的照射下進(jìn)行45 min的充分反應(yīng)，期間要進(jìn)行2次振蕩操作，完成后導(dǎo)出，倒入0.1 mL 25%氨水在無光亮的環(huán)境中放置30 min，之后移動(dòng)到60 ℃水浴鍋內(nèi)15 min，目的是清除丙酮，冷卻至室溫后，以乙腈為定容液到需求的5 mL，充分?jǐn)嚢柚辆鶆?，借?.22 μm的有機(jī)膜進(jìn)行過濾處理，之后放入小容器瓶?jī)?nèi)，等待機(jī)器測(cè)試。

2.5.3 高效液相色譜條件

色譜柱為 C18柱(柱長(zhǎng)15 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料內(nèi)徑5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm, 進(jìn)樣量為10 μm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，流動(dòng)相A為 0.1 mol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為純乙腈，兩流動(dòng)相在洗脫前需進(jìn)行抽濾，并采用超聲儀器去除氣泡。通過樣品峰面積比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積計(jì)算生物胺含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系

標(biāo)準(zhǔn)品通過濃度變化得到的峰面積作為縱坐標(biāo)，而濃度作為橫坐標(biāo)，測(cè)定可得8種生物胺的線性關(guān)系方程，見表1。

表1 生物胺的線性關(guān)系分析結(jié)果Table 1 The results of linear analysis of biogenic amines

續(xù) 表

在這8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品中，它們的濃度介于10～100 mg/L之間，有極好的線性關(guān)聯(lián)，對(duì)應(yīng)的關(guān)聯(lián)參數(shù)中，除精胺(0.9796 μL)、亞精胺(0.9434 μL)外，其余都在0.99 μL以上，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)生物胺的檢測(cè)需要。

3.2 梅香魚生物胺含量分析結(jié)果

由表2得到生物胺的檢出率為：色胺40.0%，苯乙胺95.0%，腐胺100%，尸胺100%，組胺95.0%，酪胺100%，亞精胺75.0%，精胺85.0%。

表2 市售腌制魚生物胺含量情況Table 2 The content of biogenic amines incured fish mg/kg

國(guó)家衛(wèi)生部的標(biāo)準(zhǔn)GB 2733-2005中對(duì)組胺含量的規(guī)定為:鮐魚≤100 mg/100 g，其他魚類≤30 mg/100 g的限量標(biāo)準(zhǔn)，組胺超出限量的有17條，所占比例為85%，組胺含量最高可達(dá)到132.4 mg/100 g，超出規(guī)定限量3.4倍。

根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)對(duì)生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)：水產(chǎn)品中的限量為組胺≤50 mg/kg，酪胺≤100 mg/kg。此次調(diào)查中，20份樣品中19份樣品的組胺含量均超過限量，超出限量的樣品比例為95%，所有樣品中酪胺的含量均超出限量，超出限量的樣品比例為100%。

除組胺與酪胺外，苯乙胺、腐胺、尸胺的檢出率均在90.0%以上，亞精胺與精胺的檢出率也在70.0%以上，通過本次調(diào)查分析，表明售梅香魚的生物胺含量存在極大的安全隱患。

4 結(jié)論

通過本次調(diào)查結(jié)果分析得到：色胺檢出率為40.0%，苯乙胺為95.0%，腐胺為100%，尸胺為100%，組胺為95.0%，酪胺為100%，亞精胺為75.0%，精胺為85.0%。依照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)針對(duì)生物胺的標(biāo)準(zhǔn)使用量的規(guī)定，其中組胺的最高檢出含量為132.4 mg/100 g，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出限定量，超出限定量所占比例為95%。苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺的檢出率均在90.0%以上，亞精胺與精胺的檢出率也在70.0%以上。除組胺與酪胺外，以上其他6種生物胺各國(guó)雖無限量規(guī)定，但尸胺和酪胺能夠抑制腸道中二胺氧化酶和組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，降低組胺分解，加強(qiáng)了組胺的毒性作用[10]。腐胺、尸胺等則能夠與亞硝酸鹽反應(yīng)生成亞硝胺等雜環(huán)類致癌物質(zhì)，其含量也不可忽視。

綜上所述，部分市售腌制魚中生物胺含量嚴(yán)重超過限量標(biāo)準(zhǔn)，市售腌制魚仍然存在一定安全隱患，為了保證梅香魚的安全性，加工儲(chǔ)藏工藝還需要進(jìn)一步改進(jìn)。