黑曲霉發(fā)酵蝦皮制備鈣肽絡合物膠囊

鄒漢鵬，劉漢文，路旺旺，穆立坤

鹽城工學院 海洋與生物工程學院（鹽城 224000）

蝦皮為毛蝦干制品，蛋白質質量分數(shù)為39.2%，還含有氨基酸、低肽、核苷酸等魚貝類風味相關物質[1]；礦物質蘊含豐富，其中鈣元素占2%，故素有“鈣庫”之稱[2]。中國營養(yǎng)協(xié)會推薦成人每日鈣攝入量應在800～1000 mg[3-4]。國民鈣攝入量普遍偏低，第三次營養(yǎng)調查結果顯示，我國人均每日鈣攝入量僅為400 mg，未達推薦量的50%[3-4]。近年來國內補鈣產品越來越多，銷量也在不斷增加，可是國民缺鈣的狀況依然沒有顯著改善，主要原因是鈣不能被有效利用。鈣在人體內主要通過腸道吸收，其中大腸吸收的鈣為總吸收鈣的10%，小腸吸收90%。小腸環(huán)境呈堿性，鈣離子會同小腸內的陰離子形成難溶性的鈣鹽，從而被直接排出體外，難以被吸收利用。蝦皮中的鈣含量豐富，但存在形式主要是碳磷酸鈣，傳統(tǒng)的食用方法蝦皮中的鈣并不能很好地被人體吸收利用。利用黑曲霉將蝦皮在一定條件下發(fā)酵，蛋白質水解為促鈣吸收肽，無機碳磷酸鈣中鈣的游離及被活化成鈣肽絡合物，鈣肽絡合物能以整體形式被小腸吸收，防止鈣元素在腸道變成不溶性化合物[5-7]，生物利用率大大提高，并且微膠囊化后的肽鈣絡合物膠囊可以大大提高蝦皮補鈣價值[8]，進一步提高產品的實用性能，可作為日常補鈣用品。這也為水產食品提質增效尋找了有益途徑。

1 材料與試驗方法

1.1 試驗材料與試劑

毛蝦蝦皮，市售；麩皮，購于鹽城面粉公司；黑曲霉，實驗室培養(yǎng)。

氫氧化鉀、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣、鄰-甲酚酞絡合酮、乙醇胺、硼酸、8-羥基喹啉、95%乙醇、冰醋酸、無水乙醇、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸氫二鈉等；卵磷脂、蛋白胨、瓊脂、酵母浸出膏。

1.2 試驗儀器與設備

JA203P電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；XFB-200高速多功能粉碎機，永康市久品工貿有限公司；SPX-150數(shù)顯生化培養(yǎng)箱，江蘇金壇市億通電子有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學技術儀器設備有限責任公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋，濟南鑫貝西生物技術有限公司；UV2100紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DHG-9023A臺式電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；QFN-8000S小型噴霧干燥機，上海喬楓實業(yè)有限公司；JW-40超聲波清洗槽。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備與黑曲霉的培養(yǎng)

采用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。在無菌操作條件下，制備斜面培養(yǎng)基，用接種環(huán)將黑曲霉接種到斜面培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)5 d，備用。

1.3.2 蝦皮黑曲霉發(fā)酵

將蝦皮浸泡、洗凈，再將其烘干、粉碎，稱量后，將蝦皮樣品倒入培養(yǎng)皿中搖勻，用牛皮紙密封并包裹，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，然后取出冷卻。在無菌操作條件下接入1.3.1小節(jié)斜面培養(yǎng)的黑曲霉，在設定的工藝條件下，置于生化恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定的時間，分別取出1 g發(fā)酵物加入50 mL蒸餾水，于50 ℃恒溫水浴1 h，用蒸餾水定容到100 mL，取出部分上清液，按10000 r/min離心15 min，分別測定可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量[9]。

1.3.3 可溶性鈣質量分數(shù)的測定1.3.3.1 鈣標準曲線的繪制

用鄰-甲酚酞絡合酮比色法[9-11]，以570 nm吸光度為橫坐標，可溶性鈣質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。如圖1所示。

式中：Y為每100 g（干重）蝦皮中可溶性鈣質量分數(shù)，mg/100 g；K為樣品稀釋倍數(shù)；A為吸光度；X1為麩皮添加量，%；X2為水分含量，%。

1.3.4 可溶性鈣結合量的測定

測定方法參照文獻[12-14]的試驗方法，取1 mL離心液，測定吸光度，用1.3.3小節(jié)計算可溶性鈣結合量。

1.3.5 鈣肽得率的測定

稱取一定量的發(fā)酵產物，用等質量的蒸餾水溶解，離心分離，向分離后的上清液中加入無水乙醇，充分振蕩，靜置15 min后，按10000 r/min離心15 min，將所得沉淀物烘干、稱重，計算鈣肽得率[15]。

式中：M1為醇沉淀鈣肽質量，g；M0為發(fā)酵產物質量，g。

1.4 鈣肽絡合物微膠囊化

稱取2.000 g卵磷脂粉末于三角瓶中，加入10 mL 95%乙醇潤濕，分散卵磷脂，再加入20 mL蒸餾水，充分攪拌，形成卵磷脂乳狀液。稱取3.000 g蝦皮鈣肽絡合物于燒杯中，加入20 mL蒸餾水，充分攪拌后加入到上面配制好的卵磷脂乳狀液中，攪拌均勻，于20℃水浴中超聲處理20 min，然后噴霧干燥。噴霧干燥器設置：進料泵速7 r/min，進口溫度140 ℃。

2 結果與討論

2.1 預試驗結論

在蝦皮中加入面粉、麩皮、蔗糖、葡萄糖等進行的黑曲霉生長的預試驗發(fā)現(xiàn)：加入面粉會使試樣出現(xiàn)結團現(xiàn)象，不利于黑曲霉的生長；加入蔗糖和葡萄糖時，試樣中黑曲霉生長較快；加入麩皮時，黑曲霉生長好，同時試樣比較松散，黑曲霉的生長不受試樣的影響。相對于蔗糖和葡萄糖，麩皮價格較低且來源廣泛。因此，黑曲霉發(fā)酵蝦皮制備鈣肽絡合物選用添加麩皮作為輔料。

2.2 麩皮添加量對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

分別向加有等量蝦皮的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0，5%，10%，15%，20%和25%的麩皮，控制發(fā)酵溫度37 ℃、水分50%、發(fā)酵時長5 d。測定發(fā)酵試樣中可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量，結果如圖2所示?？傮w上看，可溶性鈣質量分數(shù)一直高于可溶性鈣結合量，符合預期。當麩皮添加量為0時，可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量均較低；隨著麩皮添加量的增加，可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量也逐漸增加。當麩皮添加量達到20%時，可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量達到最高，而更高的麩皮添加量并未使可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量明顯升高。其原因在于黑曲霉發(fā)酵蝦皮的過程中，含有豐富的碳水化合物和酶系的麩皮為黑曲霉發(fā)酵提供了所需的能源和碳源，使得黑曲霉的生長代謝旺盛。當麩皮添加量達到一定限值時，其酶的作用達到了最大值，所以更多的麩皮添加量并不能使酶的作用進一步提高，因此發(fā)酵過程中形成的游離性的鈣離子質量分數(shù)和可溶性鈣結合量均不再明顯增加。經反復試驗，確定麩皮的添加量為20%。

圖2 麩皮添加量對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

2.3 溫度對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

溫度對黑曲霉生長有著很大的影響，適宜的溫度有益于黑曲霉的生長繁殖，反之則使黑曲霉生長滯后或者大量死亡。黑曲霉的最適生長溫度為37 ℃。根據(jù)黑曲霉適合生長與產酶的條件，控制麩皮添加量20%、水分50%、發(fā)酵時間5 d，控制發(fā)酵溫度在33，35，37，39和41 ℃，測定樣品中可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量。由圖3可見，溫度在37 ℃時，可溶性鈣含量、可溶性鈣結合量最高。經過驗證，將發(fā)酵溫度設定為37 ℃。

圖3 溫度對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

2.4 水分對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

水分影響黑曲霉生長環(huán)境的相對濕度和透氣性，因此黑曲霉的生長受到水分的影響。根據(jù)黑曲霉適合生長與產酶的條件，設定麩皮添加量20%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間5 d，控制水分在40%，45%，50%，55%和60%，測定樣品中可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量。由圖4可見，當水分含量較低時，可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量明顯較低，原因可能是在較低的水分下，發(fā)酵環(huán)境干燥、濕度不適宜，影響了黑曲霉的生長和產酶。當水分達到50%時，可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量含量最高。當水分含量高于50%，隨著水分的增加，可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量均降低，其原因可能是在過高的水分下，發(fā)酵環(huán)境透氣性降低，影響了黑曲霉生長與產酶。

圖4 水分對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

2.5 發(fā)酵時間對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

設定麩皮添加量20%、發(fā)酵溫度37 ℃、水分50%，發(fā)酵時間控制在3，4，5，6和7 d，測定樣品中可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量。如圖5所示，發(fā)酵1～4 d，可溶性鈣結合量、可溶性鈣質量分數(shù)均逐漸增加；發(fā)酵5 d后，可溶性鈣質量分數(shù)沒有明顯的增加，而可溶性鈣結合量逐漸減少。原因可能是隨著發(fā)酵時間的延長，黑曲霉生長過程中所產生的酶使蛋白肽陸續(xù)酶解成氨基酸，使得可溶性鈣質量分數(shù)、可溶性鈣結合量不斷增加，但是隨著黑曲霉的生長代謝，營養(yǎng)物質逐漸減少，代謝廢物逐漸增多以及各種水解酶類不斷產生，導致可溶性鈣質量分數(shù)基本不變，可溶性鈣結合量逐漸減少。

圖5 發(fā)酵時間對可溶性鈣質量分數(shù)和可溶性鈣結合量的影響

2.6 正交試驗結果

根據(jù)以上的單因素試驗分析，選取發(fā)酵溫度37℃，以水分、麩皮添加量、發(fā)酵時間為試驗因素設計正交試驗，因素水平見表1，正交試驗結果見表2，主體間效應檢驗見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結果

表3 主體間效應的檢驗

由以上正交試驗結果分析可知，對可溶性鈣結合量的影響依次是水分、麩皮添加量、發(fā)酵時間；優(yōu)化的工藝條件參數(shù)為A2B3C2，即水分50%，麩皮添加量25%，發(fā)酵時間5 d。以此發(fā)酵條件進行3組試驗，測得平均可溶性鈣質量分數(shù)為247.5 mg/100 g，平均可溶性鈣結合量為195.6 mg/100 g。

2.7 鈣肽得率

當以3倍體積的無水乙醇沉淀鈣肽時，鈣肽得率為0.481%；當無水乙醇達到4倍時，鈣肽得率為0.594%；當無水乙醇達到5倍時，鈣肽得率為0.679%；但是隨著無水乙醇繼續(xù)增加，鈣肽得率趨于平緩，其原因可能是其中鈣肽絡合物含量不變，繼續(xù)添加無水乙醇，鈣肽絡合物已經被完全沉淀。出于經濟考慮，選擇5倍體積的無水乙醇沉淀鈣肽。如圖6所示。

圖6 無水乙醇體積對鈣肽得率的影響

2.8 鈣肽絡合物膠囊化

經微膠囊化包埋的鈣肽絡合物，成品呈淡黃色粉，易吸潮，流動性較差。由于外表面包裹著一層卵磷脂，久置于空氣中易氧化，因而應在密封干燥的條件下存放。微膠囊化的鈣肽絡合物便于貯存和使用，優(yōu)勢明顯。

3 結論

利用蝦皮中含有的鈣與蛋白質資源，加入麩皮，用黑曲霉發(fā)酵使其產生鈣肽絡合物，鈣肽絡合物進入小腸后可以阻止鈣在堿性環(huán)境下形成不溶物，提高人體鈣的吸收利用率。制備成補鈣膠囊，方便實用。

毛蝦蝦皮黑曲霉發(fā)酵產生鈣肽絡合物最佳工藝條件為麩皮添加量25%、溫度37 ℃、水分50%、發(fā)酵時間5 d，測得可溶性鈣質量分數(shù)為247.5 mg/100 g，可溶性鈣結合量為195.6 mg/100 g，肽鈣得率為0.679%。與用米曲霉發(fā)酵蝦皮產生鈣肽絡合物結論基本相同，米曲霉發(fā)酵蝦皮可溶性鈣結合量為為168.5±7 mg/100 g，鈣肽得率為0.625%±0.01%[8]。黑曲霉發(fā)酵可溶性鈣結合量和鈣肽得率更高。黑曲霉安全，成本低，更適合大規(guī)模生產。