馬宗賓 趙永輝 劉倩玲 張智文

(河南大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院 華中阜外醫(yī)院，河南 鄭州 450003)

心房顫動(dòng)(房顫)是臨床常見的一種心律失常，人群中房顫的發(fā)生率約為0.4%，房顫的患病率及發(fā)病率均隨年齡增長(zhǎng)而逐步增加，中國(guó)房顫患者年齡<60歲男女患病率分別為0.43%和0.44%，年齡>60歲男女患病率分別增長(zhǎng)至1.83%和1.92%[1]。房顫患者發(fā)生缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)是非房顫患者的4～5倍，因此闡明房顫發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制是目前治療房顫的關(guān)鍵。房顫的發(fā)生通常與心臟病理有關(guān)，這些病理包括高血壓心臟病、心肌病、瓣膜病或動(dòng)脈粥樣硬化等，但它也可在無先前心臟病理或任何已知危險(xiǎn)因素的情況下出現(xiàn)[2]，這類情況下的房顫通常被稱為孤立性房顫。孤立性房顫中有家族史者稱為家族性房顫，家族性房顫與基因變異密切相關(guān)。本研究應(yīng)用全外顯子測(cè)序技術(shù)結(jié)合Sanger測(cè)序法對(duì)1例房顫患者及其家系成員進(jìn)行基因篩查，確定該家族房顫相關(guān)致病基因及變異類型，進(jìn)一步闡述了房顫發(fā)病的分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)房顫的早期診斷、遺傳干預(yù)以及對(duì)房顫的基因組學(xué)研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

本研究共納入研究對(duì)象111例，其中先證者及其家系三代成員10例(男性7例，女性3例)，健康組共101例(男性60例，女性41例)。房顫診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《2019 AHA/ACC/HRS房顫患者管理指南》。先證者是1例55歲男性患者(Ⅱ-3)(見圖1)，間斷心悸和胸悶4年，多于活動(dòng)后發(fā)生，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為“陣發(fā)性房顫、高血壓”，每日口服美托洛爾緩釋片47.5 mg，效果不佳，心電圖顯示：心律失常、快速性房顫。于河南省人民醫(yī)院行“經(jīng)心導(dǎo)管射頻消融術(shù)”，術(shù)后未再發(fā)房顫。先證者父親(Ⅰ-1)間斷胸悶和心悸，最初心電圖檢查顯示“頻發(fā)房性期前收縮，短陣房性心動(dòng)過速”，后發(fā)展為陣發(fā)性房顫。先證者哥哥(Ⅱ-2)4年前同樣因間斷心悸就診于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院，心電圖顯示“快速性房顫”，2年前于本院行射頻導(dǎo)管消融術(shù)后恢復(fù)竇性心律，未再復(fù)發(fā)。先證者的弟弟(Ⅱ-5)和妹妹(Ⅱ-7)近2年來存在活動(dòng)后心慌等癥狀，就診于本院，心電圖均顯示“持續(xù)性房顫”，房顫持續(xù)2年余，口服藥物治療，均未行射頻導(dǎo)管消融術(shù)。先證者外甥(Ⅲ-4)有晨起突發(fā)胸悶不適，初次就診時(shí)心電圖未見明顯異常，但6個(gè)月的隨訪后，其動(dòng)態(tài)心電圖呈陣發(fā)性房顫發(fā)作。

注：○表示為女性，■●表示為發(fā)病者，□表示為男性，/表示為已死亡，↘表示為先證者。

1.2 方法

收集先證者及其家系的臨床資料，包括病史采集和體格檢查，采集12導(dǎo)聯(lián)心電圖和超聲心動(dòng)圖，繪制家系圖譜(見圖1)。所有研究對(duì)象簽署知情同意書后，采集其外周血標(biāo)本，提取送檢樣本的基因組DNA，經(jīng)片段化、連接接頭、擴(kuò)增純化后，使用雜交捕獲方法制備DNA文庫，然后采用高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)人類全外顯子組中20 099個(gè)基因的外顯子區(qū)域及旁側(cè)內(nèi)含子區(qū)域(20 bp)。將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19(GRCh37)參考序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度和測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估(受檢者參數(shù)見表1)。

參照2015年版美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)指南對(duì)變異的致病性評(píng)估，當(dāng)檢出的致病或可能致病變異存在于常染色體隱性基因中時(shí)，實(shí)驗(yàn)室通過高通量測(cè)序以及Sanger測(cè)序法確保該基因編碼序列的覆蓋率為100%。確定致病基因后對(duì)先證者家系其余成員進(jìn)行相同位點(diǎn)檢測(cè)，通過與患者妻子及100例健康人相應(yīng)基因位點(diǎn)對(duì)照得出結(jié)論。最后使用Polyphen2、MutationTaster和Provean三種軟件進(jìn)行突變基因功能檢測(cè)，利用Swiss-Model軟件分析突變前后的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果

通過對(duì)先證者進(jìn)行基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者存在NEXN基因雜合變異c.919C>A(p.P307T)和JPH2基因雜合變異c.1088G>A(p.R363H)。

NEXN基因雜合變異導(dǎo)致核苷酸編碼的序列第919位堿基由C變?yōu)锳，導(dǎo)致編碼的307位氨基酸由脯氨酸突變?yōu)樘K氨酸(p.P307T)(圖2)。JPH2基因雜合變異導(dǎo)致核苷酸編碼的序列第1 088位堿基由G變?yōu)锳，導(dǎo)致編碼的363位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(p.R363H)(圖3)。

圖2 NEXN基因c.919C>A雜合變異位點(diǎn)

圖3 JPH2基因c.1088G>A雜合變異位點(diǎn)

對(duì)該家系除先證者外其余9位家庭成員及101例健康人員分別進(jìn)行NEXN基因和JPH2基因掃描發(fā)現(xiàn)，先證者家系有4例攜帶NEXN基因突變(Ⅰ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-7和Ⅲ-4)，2例攜帶JPH2基因突變(Ⅰ-1和Ⅱ-9)，其中先證者父親同時(shí)存在上述兩種突變(表2)。先證者妻子(Ⅱ-4)及100例健康對(duì)照者中未檢測(cè)出NEXN基因c.919C>A(p.P307T)變異及JPH2基因c.1088G>A(p.R363H)變異。

表2 先證者家系其余成員變異基因攜帶及發(fā)病情況

兩種突變所在區(qū)域的氨基酸序列高度保守，Polyphen2、MutationTaster和Provean三種軟件預(yù)測(cè)該位點(diǎn)的NEXN基因雜合變異和JPH2基因雜合變異均為有害變異。Swiss-Model軟件預(yù)測(cè)突變后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致蛋白功能的改變，從而引起疾病的發(fā)生(圖4和圖5)。

圖4 NEXN基因c.919C>A(p.P307T)突變蛋白的結(jié)構(gòu)模擬圖

圖5 JPH2基因c.1088G>A(p.R363H)突變蛋白的結(jié)構(gòu)模擬圖

3 討論

房顫的發(fā)生受多種因素影響，遺傳是其中重要的因素之一，具有家族性房顫史者，若一級(jí)親屬確診房顫，則本人罹患房顫的風(fēng)險(xiǎn)增加約40%[3]。房顫的病理生理機(jī)制主要是心房重構(gòu)、自主神經(jīng)調(diào)節(jié)、房顫時(shí)心房肌組織腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性升高等方面[4]，房顫患者多表現(xiàn)為心悸、頭暈、胸悶和乏力等癥狀。本研究在1個(gè)房顫家系中發(fā)現(xiàn)NEXN基因c.919C>A(p.P307T)雜合突變和JPH2基因c.1088G>A(p.R363H)雜合突變。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該突變可能是新的致病基因。

NEXN基因編碼Nexilin，Nexilin是一種心臟Z盤蛋白，其功能是保護(hù)心臟Z盤免受肌節(jié)內(nèi)產(chǎn)生的力，Nexilin突變使心臟Z盤不穩(wěn)定，導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病[5]。有研究證實(shí)NEXN是中國(guó)漢族人群中一種新型的冠狀動(dòng)脈疾病易感基因[6]。目前證實(shí)NEXN基因相關(guān)疾病為擴(kuò)張型心肌病1CC型和肥厚型心肌病20型，是常染色體顯性遺傳。臨床表現(xiàn)主要為心臟擴(kuò)大、左心室肥大、室間隔增厚、房顫、降低的左室收縮功能和左室舒張功能等[7]。NEXN基因的p.P307T變異未在相關(guān)臨床病例中被報(bào)道過。依據(jù)美國(guó)ACMG變異分類指南[8]，這個(gè)變異為“3類-意義未明”，結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，推斷NEXN基因的p.P307T變異為房顫致病基因變異位點(diǎn)。

JPH2基因編碼Junctophilin-2蛋白(JPH2蛋白)，JPH2蛋白主要分布在心肌組織，是存在于心肌細(xì)胞膜L型鈣通道與肌質(zhì)網(wǎng)RyR2(心肌細(xì)胞釋放鈣離子的通道)間的膜偶聯(lián)復(fù)合物，是可興奮細(xì)胞和參與細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[9]，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控發(fā)揮重要作用。JPH2基因的改變會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)異常，繼而引起心力衰竭、心肌病和心律失常等一系列疾病。有研究[10]發(fā)現(xiàn)JPH2基因在房顫時(shí)明顯下調(diào)，這表明房顫使JPH2蛋白功能下調(diào)，心房肌興奮收縮脫偶聯(lián)，興奮收縮偶聯(lián)效率降低，細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而影響心房肌的收縮功能。Sabater-Molina等[11]研究發(fā)現(xiàn)JPH2基因突變可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病。Beavers等[12]研究證實(shí)JPH2基因中的E169K突變會(huì)導(dǎo)致RyR2穩(wěn)定性受損，導(dǎo)致房顫。目前JPH2基因的p.R363H變異未在相關(guān)臨床病例中被報(bào)道過。依據(jù)美國(guó)ACMG變異分類指南[8]，這個(gè)變異為“3類-意義未明”。結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)，筆者推斷JPH2基因的p.R363H變異為房顫致病基因變異位點(diǎn)。

綜上所述，本研究利用二代測(cè)序技術(shù)在1個(gè)中國(guó)房顫家系中發(fā)現(xiàn)了NEXN基因c.919C>A(p.P307T)雜合突變和JPH2基因c.1088G>A(p.R363H)雜合突變，該突變位點(diǎn)在中國(guó)未見報(bào)道。該家系三代成員10人中有6人為房顫患者，2人同時(shí)攜帶上述兩種突變，而101例健康人均不存在上述突變，該突變位點(diǎn)可能是該家系房顫的致病基因。利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)房顫患者家系進(jìn)行檢測(cè)，有助于明確房顫患者及其家系成員遺傳易感性，篩查家族性房顫的突變基因，對(duì)房顫家系成員的早期診斷具有明確價(jià)值，對(duì)突變攜帶者進(jìn)行早期干預(yù)及治療具有重要的指導(dǎo)意義[13]。但本研究尚存在一定局限性，本研究中該家系存在NEXN和JPH2基因變異，這種變異與患者家系成員發(fā)生房顫密切相關(guān)，但目前未能進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)此類基因變異導(dǎo)致房顫發(fā)生的具體機(jī)制。