高原鏈帶藻抗氧化蛋白分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

孔婉瑩 李旭 洪瑜 胡云龍

眾所周知，人類一切疾病的根源都是因?yàn)樽杂苫?，自由基會影響?xì)胞的活性，嚴(yán)重的還會殺滅細(xì)胞，因此，要想保證人體健康，就必須要清除自由基，而抗氧化物則可以有效地解決這一問題?？寡趸锿ㄟ^清除體內(nèi)的自由基，同時(shí)減少組織氧化，以此來達(dá)到保護(hù)機(jī)體的最終目的。天然的抗氧化物相較于合成物而言，有著更好的應(yīng)用效果，其副作用小，同時(shí)能夠降低免疫系統(tǒng)活性的干擾，因而有著更好的促氧化效果。

高原鏈帶藻是從我國西藏那曲青龍鄉(xiāng)普保巴村巴木錯湖分離得到的，經(jīng)過初步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高原鏈帶藻在常溫常壓的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，其在培養(yǎng)基中生長6d之后，藻類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量達(dá)到了71.68%，同時(shí)對蛋白粗提取物進(jìn)行測試后發(fā)現(xiàn)，其蛋白具有一定的抗氧化性，能夠有效地對氫氧根離子以及DPPH自由基進(jìn)行清除，且清除能力較強(qiáng)。本文中主要針對高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行分析，利用柱層析方法進(jìn)行高原連帶藻蛋白的分離純化，并結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)的測試，以此來對高原鏈帶藻抗氧化蛋白進(jìn)行更為深入的檢測研究。

一、材料與方法分析

1.高原鏈帶藻的培養(yǎng)及蛋白粗提取。在進(jìn)行高原鏈帶藻的培養(yǎng)過程中，首先在500mL的搖瓶中加入250mL的BG11培養(yǎng)液，進(jìn)行接種時(shí)其濃度為1×106個(gè)/mL，同時(shí)培養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，光照條件為108μmol/（㎡·s），光暗周期則為12L。在該培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6天后進(jìn)行抽濾操作，收集所需要的高原鏈帶藻細(xì)胞，將之進(jìn)行冷凍處理，備用。

在進(jìn)行高原鏈帶藻抗氧化蛋白的粗提取時(shí)，首先需要取凍干的微藻細(xì)胞粉末50mg放入研缽中，在冰水浴的條件下進(jìn)行研磨，取其上清液，利用緩沖溶液定容，最后加入硫酸銨直到其飽和度的80%，攪拌均勻后待用。靜置30min之后，收集蛋白沉淀并用磷酸緩沖液進(jìn)行再次溶解，再經(jīng)過后續(xù)一系列的操作后便完成了蛋白的粗提取。

2.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。進(jìn)行抗氧化蛋白的分離純化時(shí)，需要使用到AKTA Prime蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行操作。在此過程中，首先將蛋白的濃縮液濃度調(diào)節(jié)為20mg/mL，并在填料柱上樣1mL，使用氯化鈉溶液溶于磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，控制好洗脫的流速，由此來收集各峰的組分。收集到各個(gè)部分的組分之后，需要使用磷酸緩沖溶液進(jìn)行再次溶解，將蛋白的濃度控制在8mg/mL，再用1mol/L的氯化鈉和氫氧化鈉溶液分別沖洗，由此便將所得到的抗氧化蛋白進(jìn)行了再次的分離純化，所得到的最終產(chǎn)品也更為純凈。

3.高原鏈帶藻結(jié)構(gòu)的鑒定分析。進(jìn)行高原鏈帶藻抗氧化蛋白結(jié)構(gòu)的鑒定分析時(shí)，首先需要將10μg純化后的抗氧化蛋白用50mmol/L的TEAB緩沖溶液復(fù)溶，之后加入0.2μg的混合酶液，在37℃的條件下進(jìn)行酶解，6h之后將產(chǎn)物多肽進(jìn)行低溫真空干燥，并使用乙腈溶液進(jìn)行復(fù)溶，產(chǎn)物進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，即利用相關(guān)軟件對質(zhì)譜圖所對應(yīng)的多肽段序列進(jìn)行分析。在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還可以使用Phyre2在線程序進(jìn)行高級結(jié)構(gòu)的模擬分析。

二、結(jié)果與分析

1.高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化。高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化都是在4℃的條件下進(jìn)行的，經(jīng)過離子交換柱的分離之后，得到了3個(gè)主要的蛋白峰，且洗脫體積為22-77mL時(shí)洗脫液顯示了抗氧化活力。在此過程中，抗氧化蛋白也得到了較好的分離，其總質(zhì)量為5.7mg。

2.抗氧化蛋白處理對于細(xì)胞MDA水平和SOD、CAT活力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氧化脅迫能夠促使產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)MDA，由此便破壞了細(xì)胞膜的完整性，同時(shí)也會導(dǎo)致SOD和CAT失活，這三方面的指標(biāo)都能在一定程度上反映出細(xì)胞受到自由基攻擊的程度，經(jīng)過過氧化氫處理后的細(xì)胞中，MDA、SOD以及CAT的含量都有所變化，其具體的影響如表1所示。

3.高原鏈帶藻抗氧化蛋白結(jié)構(gòu)。通過質(zhì)譜分析可知，高原鏈帶藻抗氧化蛋白主要是由408個(gè)氨基氨基酸按照一定序列所組成的，且經(jīng)過ExPasy在線程序的分析顯示，其蛋白質(zhì)分子量為44.8kD。

本文中對于高原鏈帶藻抗氧化蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)行了分析探討，由此對于高原鏈帶藻有了更為深入的認(rèn)識。