葡萄籽提取物緩解砷中毒氧化應(yīng)激的作用研究進(jìn)展

王澤蘭 王亞潔

葡萄籽提取物是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酚類物質(zhì)，廣泛存在于植物性食物中，主要由原花青素、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、表兒茶素沒食子酸酯等多酚類物質(zhì)組成。葡萄籽提取物是純天然物質(zhì)，也是迄今發(fā)現(xiàn)的植物來源最高效的抗氧化劑之一，其抗氧化效果是維生素C和維生素E的30-50倍，可以通過多條途徑及多種分子機(jī)制表現(xiàn)出抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等生理功能。

砷是元素周期表中的第33個(gè)元素，具有金屬和非金屬的特征，因此被稱為類金屬，可以來自自然和人為的土壤、水和空氣。隨著科技的發(fā)展，砷被廣泛用于化妝品、木材防腐劑、棉花干燥劑、殺蟲劑等多領(lǐng)域，甚至被用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病。從生物學(xué)和毒理學(xué)角度，砷化合物分為無機(jī)砷化合物、有機(jī)砷化合物和砷氣，其中無機(jī)砷主要包括三氧化二砷、亞砷酸鹽、三氯化砷等三價(jià)砷，以及五氧化二砷、胂酸、砷酸鹽等五價(jià)砷；常見的有機(jī)砷包括對氨基苯胂酸、一甲基胂酸、二甲基胂酸、砷甜菜堿。

砷暴露會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，通過改變信號通路和表觀遺傳修飾對細(xì)胞進(jìn)行多種改變，或?qū)Ψ肿又苯釉斐裳趸瘬p傷。長期砷暴露與多種疾病有關(guān)，例如癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病、腎臟疾病等。由于飲用水中無機(jī)砷的污染，致使全世界超過1.4億人的健康受到威脅，因此砷中毒是一個(gè)全球性的健康問題。

砷的毒性機(jī)制很復(fù)雜，目前尚未完全了解，由活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是砷的共同毒性特征，而葡萄籽提取物中富含的多酚類物質(zhì)具有顯著改善氧化應(yīng)激的作用。ROS包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧自由基等，在砷中毒中主要參與的ROS途徑包括Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件信號通路、微小脫氧核糖核苷酸、線粒體自噬途徑、酪氨酸磷酸化系統(tǒng)、絲裂原活化蛋白激酶、核因子NF-κB等。本文介紹了參與砷誘導(dǎo)的氧化還原途徑，希望為葡萄籽提取物應(yīng)用于砷中毒的預(yù)防和治療提供新思路。

一、Nrf2-ARE途徑

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是抗氧化系統(tǒng)中的主要轉(zhuǎn)錄因子，在生理?xiàng)l件下Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平較低，與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）形成E3泛素連接酶復(fù)合物，隨后被Nrf2降解。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生過量的ROS，Keap1中的某些半胱氨酸殘基（C273、C288和C151）被S-烷基化，導(dǎo)致Keap1介導(dǎo)的Nrf2降解受損。然后Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中積累、在細(xì)胞核中易位，與小分子形成二聚體并激活抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）依賴的基因表達(dá)。研究表明，葡萄籽提取物中豐富的原花青素能夠上調(diào)Nrf2及下游基因的mRNA水平，還能夠使Nrf2及下游相關(guān)蛋白含量上調(diào)，從而使SOD、GSH、GSHPX、T-AOC的水平上升，進(jìn)而降低MDA含量以緩解機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。因此，Nrf2-ARE途徑的作用在葡萄籽抑制砷毒性的研究中引起了廣泛的關(guān)注。

二、microRNAs

表觀遺傳修飾通過砷暴露導(dǎo)致毒性作用，主要通過修飾miRNAs，并且與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，慢性砷暴露導(dǎo)致ROS過量產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)激活miR-199a-5p/缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/環(huán)氧合酶-2（COX-2）通路。機(jī)體過量的ROS通過增加miR-199a基因的啟動(dòng)子甲基化，從而抑制miR-199a的表達(dá)。在砷誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化中，并非miRNA的所有改變都與ROS有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在人支氣管上皮細(xì)胞（16-HBE）中，miR-155通過誘導(dǎo)Nrf2導(dǎo)致亞砷酸鹽誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化，但通過二氯二氫熒光素測定，在砷轉(zhuǎn)化細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生并沒有發(fā)生顯著變化。ROS的水平可以由miRNA調(diào)節(jié)，如在腦缺血、脊髓缺血/再灌注損傷等疾病中，miRNA-20b過表達(dá)增加了5三磷酸腺苷（ATP）的水平和ROS在SD大鼠腦缺血中的作用，而抑制miRNA-20b則降低了ROS的水平。miR-451過表達(dá)降低了細(xì)胞凋亡率，枸杞多糖可以通過下調(diào)PC-12細(xì)胞中miR-194的誘導(dǎo)，從而降低ROS和NO的水平。

了解砷誘導(dǎo)毒性的分子機(jī)制，例如ROS的生成動(dòng)力學(xué)、miRNA表達(dá)以及ROS和miRNA之間的關(guān)系，可以為抗砷毒性戰(zhàn)略提供新思路。然而到目前為止，只有少數(shù)研究涉及砷毒性的分子機(jī)制探索，未來需要著重了解ROS改變與miRNA表達(dá)之間的潛在關(guān)系，其中研究ROS在表觀遺傳失調(diào)中的作用將成為重中之重。

三、線粒體自噬

線粒體作為組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)必不可少的能量發(fā)生器以及程序性凋亡和壞死細(xì)胞死亡的通道，其質(zhì)量和數(shù)量受到嚴(yán)格控制。線粒體自噬（Mitophagy）是細(xì)胞自噬裝置對線粒體的靶向吞噬和破壞，通常被認(rèn)為是線粒體質(zhì)量控制的主要機(jī)制。線粒體是ROS產(chǎn)生和釋放的主要場所，中度活性氧線粒體自噬對細(xì)胞增殖和存活至關(guān)重要，然而ROS水平過高則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此外線粒體中不斷產(chǎn)生的ROS可導(dǎo)致細(xì)胞自噬、凋亡或壞死。一方面，砷具有線粒體毒性，導(dǎo)致線粒體腫脹和嵴碎裂，擾亂呼吸復(fù)合體，并產(chǎn)生ROS；另一方面，過量的ROS生成會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙。葡萄籽提取物對線粒體損傷具有保護(hù)作用，研究顯示，葡萄籽低聚原花青素通過線粒體糖代謝酶途徑，對順鉑導(dǎo)致的人胚腎細(xì)胞線粒體損傷具有保護(hù)作用。

線粒體自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的選擇性自噬，可以有效清除機(jī)體細(xì)胞內(nèi)由各種原因所產(chǎn)生的受損線粒體，維持細(xì)胞的能量和物質(zhì)代謝，保持細(xì)胞正常的功能狀態(tài)。目前已知調(diào)控哺乳動(dòng)物中線粒體自噬的機(jī)制主要有兩種：一種是parkin（E3 ubiquitin-protein ligase parkin）依賴性的，即線粒體外膜蛋白PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）介導(dǎo)的線粒體自噬；另一種是parkin非依賴性的，包括缺氧介導(dǎo)的線粒體自噬及Bnip3/Nix介導(dǎo)的線粒體自噬。近幾年的研究表明，PINK1和parkin是調(diào)控線粒體自噬的重要組分，有助于維持線粒體的正常功能。

由于對潛在致病機(jī)制的不完全了解，砷中毒的有效預(yù)防和治療策略在全球范圍內(nèi)仍是一個(gè)挑戰(zhàn)，ROS改變則是公認(rèn)的砷毒性中的關(guān)鍵事件。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。早期急性暴露和相對高劑量砷的研究表明，過量的ROS會(huì)干擾細(xì)胞信號通路以及損傷大分子，但現(xiàn)實(shí)環(huán)境中ROS的機(jī)制和功能可能有所不同，長期低劑量砷暴露也會(huì)影響數(shù)百萬人的健康。此外，砷的體外暴露測定濃度可能會(huì)影響潛在的體內(nèi)毒性生物分子效應(yīng)，從而使用于風(fēng)險(xiǎn)評估的劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)缺失。

我國植物性食物來源豐富，其中富含有益于身體健康的營養(yǎng)物質(zhì)，以及具有一定生理功能的植物化學(xué)物。大量研究顯示，葡萄籽提取物原花青素能夠特異性附著在內(nèi)皮細(xì)胞表面，清除胞外有害自由基，保護(hù)心血管；能夠抵抗各種化學(xué)藥物對各臟器的毒性作用；能夠損傷腫瘤細(xì)胞線粒體，激活caspases并干擾促有絲分裂信號激活JNK，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；能夠增強(qiáng)血管表皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合，并能增強(qiáng)纖維原細(xì)胞的遷移和增殖，促進(jìn)組織修復(fù)；能夠抑制趨化受體的表達(dá)，抵抗HIV感染等多種生物藥理活性。如何充分發(fā)揮這類物質(zhì)的功效，使其在人類亞健康的改善及常見慢性病的預(yù)防甚至治療等領(lǐng)域充分發(fā)揮功效，成為現(xiàn)今關(guān)注的熱點(diǎn)。因此，葡萄籽提取物在砷毒性中緩解氧化應(yīng)激的重要作用的闡明，將會(huì)為疾病的預(yù)防與治療提供新思路與新策略。