張媛婷，夏藝菲，何曉琦，劉 暢，張志國(guó)

大慶師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712

茶葉在中國(guó)已有上千年的歷史。茶葉在飲品中擁有崇高地位的原因在于它含有大量的茶多酚[1]。茶多酚具有抗氧化、延緩衰老、降血脂和降血糖等功能，并對(duì)人體無(wú)毒副作用[2]。中國(guó)茶葉物產(chǎn)豐富，種類繁多[3]，科學(xué)高效提取茶葉中的茶多酚具有重要意義。

目前，茶多酚常用的提取方法有溶劑萃取法、離子沉淀法和超聲波輔助浸提法等[4]。超聲波輔助浸提法工藝簡(jiǎn)單、提取溫度低、產(chǎn)品得率高、安全性高[4-5]。超聲波輔助提取茶多酚雖然在國(guó)內(nèi)已有大量研究，但各研究所得工藝參數(shù)相差很大[6-7]。我國(guó)茶葉分為綠茶、白茶、黃茶、青茶、紅茶和黑茶等六大類，本文主要探討超聲波提取綠茶和白茶中茶多酚的優(yōu)化工藝，同時(shí)通過(guò)羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)和總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)測(cè)定評(píng)價(jià)兩種茶葉中茶多酚的抗氧化活性，以期為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠茶：浙江浦江，春茶，一級(jí)；白茶：福建南平，春茶，一級(jí)。

1.2 試劑與儀器

茶多酚，上海源葉生物科技有限公司；TPTZ（三吡啶三吖嗪），sigma-Aldrich公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼），sigma-Aldrich公司；無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

AGBP210S電子天平，Sartorius公司；UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上?？茖W(xué)精密儀器廠；SK3310HP型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚的提取

綠茶、白茶→粉碎過(guò)篩（40目）→加入一定濃度乙醇超聲提取→過(guò)濾→茶多酚提取液。

1.3.2 茶多酚含量測(cè)定

稱取0.5 g茶多酚，定容至100 mL。分別取 0.0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL和0.5 mL，加水至10 mL，加酒石酸亞鐵溶液5 mL，混勻后加磷酸緩沖液至刻度，混勻后放置10 min。550 nm測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)酒石酸亞鐵比色法，結(jié)合茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，測(cè)定并計(jì)算茶多酚提取率[6-8]。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

按“1.3.1”實(shí)驗(yàn)，考察超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）、料液比（1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL、1∶40 g/mL、1∶50 g/mL、1∶60 g/mL）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%、100%）和超聲時(shí)間（10 min、30 min、50 min、70 min、90 min、110 min）對(duì)茶多酚提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)（表1、表2）。

表1 綠茶正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for green tea

表2 白茶正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 2 Factors and levels of orthogonal test for white tea

1.3.5 茶多酚抗氧化活性測(cè)定

茶多酚清除羥基自由基能力的測(cè)定參照謝丹丹的方法進(jìn)行[10]；清除DPPH自由基能力的測(cè)定參照奕志英和陳安徽的方法進(jìn)行[11-12]；總抗氧化能力的測(cè)定參照楊皓彬和黃婷的方法進(jìn)行[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

得到回歸方程為：y = 0.0035x-0.0019，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9991，x為茶多酚濃度，y為吸光度值。茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of tea polyphenols

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲溫度對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖2可知：當(dāng)超聲溫度為70℃時(shí)，綠茶和白茶中茶多酚提取率達(dá)到峰值，溫度再升高提取率下降。這可能是因?yàn)殡S著溫度的升高，茶多酚類物質(zhì)在溶劑中的溶解度增加，從而使得其提取率升高，但是由于茶多酚類物質(zhì)不耐高溫，溫度過(guò)高會(huì)使得茶多酚的結(jié)構(gòu)被破壞，從而最終使茶多酚的提取率降低。因此，提取茶多酚的適宜溫度為70℃。

圖2 超聲溫度對(duì)茶多酚提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.2 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖3可知：當(dāng)料液比小于1∶50 g/mL時(shí)，綠茶和白茶中茶多酚的提取率隨著料液比的增大逐漸升高，當(dāng)料液比大于1∶50 g/mL時(shí)，綠茶和白茶中茶多酚的提取率隨著料液比的增大而有所下降。分析可知，在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，料液比的增加有利于茶葉中茶多酚的溶出，使茶多酚溶解度增大，但當(dāng)料液比到達(dá)一定數(shù)值后，溶劑中蛋白質(zhì)與果膠等雜質(zhì)的含量也增加，從而抑制茶葉中茶多酚的溶出，最終使得茶葉中茶多酚的提取率降低?？梢?jiàn)，提取綠茶和白茶中茶多酚適宜料液比均為1∶50 g/mL。

圖3 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響Figure 3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.3 乙醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖4可知：當(dāng)乙醇濃度為80%和90%時(shí)，綠茶和白茶茶多酚提取率分別達(dá)峰值。再增加乙醇濃度，提取率降低，可能是由于溶劑與多酚物質(zhì)的極性相似程度降低[15]。因此，提取綠茶和白茶中茶多酚的適宜乙醇濃度分別為80%和90%。

圖4 乙醇濃度對(duì)茶多酚提取率的影響Figure 4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of tea polyphenols

2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響

由圖5可知：當(dāng)超聲時(shí)間為90 min時(shí)，綠茶茶多酚提取率達(dá)到峰值；當(dāng)超聲時(shí)間為70 min時(shí)，白茶茶多酚提取率達(dá)到峰值。上述現(xiàn)象主要是因?yàn)槌晻r(shí)間越長(zhǎng)茶葉中的茶多酚溶出的越多，但是茶多酚不穩(wěn)定，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)茶多酚會(huì)被逐漸破壞，從而使其提取率降低?？梢?jiàn)，提取綠茶和白茶中茶多酚的適宜超聲時(shí)間分別為90 min和70 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響Figure 5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of tea polyphenols

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，綠茶茶多酚的最佳提取條件為：超聲溫度60℃，料液比1∶50 g/mL，乙醇濃度70%，超聲時(shí)間110 min。

表3 綠茶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of green tea

由表4可知，白茶茶多酚的最佳提取因素為：超聲溫度為70℃，料液比為1∶60 g/mL，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間90 min。

表4 白茶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of white tea

以超聲溫度為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。由表5可知，各因素對(duì)綠茶茶多酚提取率影響的主次順序?yàn)槌晻r(shí)間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度，與極差結(jié)果相符，其中超聲時(shí)間對(duì)綠茶茶多酚提取率具有顯著影響。

表5 綠茶正交試驗(yàn)方差分析表Table 5 Analysis of variance of green tea orthogonal test

以超聲溫度為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析。由表6可知，各因素對(duì)白茶茶多酚提取率影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛?、料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度與極差結(jié)果相符，其中乙醇濃度對(duì)白茶茶多酚提取率具有顯著影響。

表6 白茶正交試驗(yàn)方差分析表Table 6 Analysis of variance of white tea orthogonal test

2.4 茶多酚的抗氧化活性

2.4.1 清除羥基自由基能力

由圖6可知：綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)羥基自由基最高清除率分別為：綠茶94.74%、白茶78.95%和Vc 57.90%。綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)羥基自由基的清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)綠茶茶多酚濃度達(dá)到150.00 μg/mL時(shí)，清除率增加逐漸變緩；白茶茶多酚濃度達(dá)到125.00 μg/mL時(shí)，清除率增加逐漸變緩；Vc對(duì)羥基自由基的清除率遠(yuǎn)小于綠茶和白茶中茶多酚對(duì)羥基自由基的清除率，即茶多酚的抗氧化能力強(qiáng)于Vc。根據(jù)清除率擬合曲線，得到綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)羥基自由基的IC50分別為76.76 μg/mL、101.29 μg/mL 和 145.17 μg/mL。比較可知，對(duì)羥基自由基的IC50大小順序?yàn)椋壕G茶茶多酚<白茶茶多酚

圖6 茶多酚清除羥基自由基能力Figure 6 Hydroxyl radical scavenging ability of tea polyphenols

2.4.2 清除DPPH自由基能力

由圖7可知：綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)DPPH最高清除率分別為：綠茶97.96%、白茶86.28%和Vc 36.17%。綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸升高，當(dāng)綠茶茶多酚濃度達(dá)到75.00 μg/mL時(shí)，清除率增加逐漸變緩；白茶茶多酚濃度達(dá)100.00 μg/mL時(shí)，清除率增加而逐漸變緩；Vc的最大清除率遠(yuǎn)小于綠茶和白茶中茶多酚清除率，即茶多酚的抗氧化能力強(qiáng)于Vc。根據(jù)清除率擬合曲線，得到綠茶茶多酚、白茶茶多酚以及Vc對(duì)DPPH自由基的IC50分別為 47.53 μg/mL、69.55 μg/mL 和 156.12 μg/mL。比較可知，DPPH自由基的IC50大小順序?yàn)椋壕G茶茶多酚<白茶茶多酚

圖7 茶多酚清除DPPH自由基能力Figure 7 DPPH radical scavenging ability of tea polyphenols

2.4.3 總抗氧化能力

由圖8可知：在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值隨茶多酚濃度增加而增大，樣品濃度與FRAP值呈正相關(guān)。相同濃度時(shí)，F(xiàn)RAP值越大代表物質(zhì)的總抗氧化能力越強(qiáng)?？梢?jiàn)，綠茶和白茶中茶多酚的FRAP值遠(yuǎn)高于陽(yáng)性對(duì)照Vc。因此，茶多酚的總抗氧化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于Vc，并且綠茶總抗氧化能力強(qiáng)于白茶總抗氧化能力。

圖8 茶多酚總抗氧化能力Figure 8 Total antioxidant ability of tea polyphenols

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取技術(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到綠茶和白茶中茶多酚的最佳提取工藝為：綠茶超聲溫度60℃、料液比1∶50 g/mL、乙醇濃度70%、超聲時(shí)間110 min，白茶超聲溫度70℃、料液比1∶60 g/mL、乙醇濃度80%、超聲時(shí)間90 min。兩種茶葉中茶多酚的提取率分別為：綠茶19.68%，白茶12.07%。張素霞等利用超聲波輔助提取技術(shù)得到綠茶茶多酚的提取率為11.13%[16]。楊皓彬等采用水提法提取白茶中茶多酚，提取率為5.65%[13]。與張素霞、楊皓彬的提取工藝相比較，本試驗(yàn)得出的最佳提取工藝均可更高效的提取出綠茶和白茶中的茶多酚。

抗氧化試驗(yàn)中，對(duì)羥基自由基的IC50值分別為：綠茶茶多酚76.76 μg/mL、白茶茶多酚101.29 μg/mL 和 Vc 145.17 μg/mL；對(duì) DPPH 自由基的IC50值分別為：綠茶茶多酚47.53 μg/mL、白茶茶多酚 69.55 μg/mL 和 Vc 156.12 μg/mL。比較可知，對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的IC50值：綠茶茶多酚<白茶茶多酚