向澤棟 薛晴 于海濤 孫志強(qiáng) 李震 劉菊妍 張加余 高鵬 代龍

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）16-1964-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.08

摘 要 目的：建立同時(shí)測定經(jīng)典名方槐花散中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素和胡薄荷酮等5種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜波長切換法。色譜柱為Cosmosil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），檢測波長依次為257 nm（蘆?。?、283 nm（柚皮苷、新橙皮苷）、254 nm（槲皮素）、252 nm（胡薄荷酮），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為21.7～2 170、46～4 600、22.3～2 230、0.96～96、2.7～270 μg/mL（r均大于0.999）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%（n=6）;平均加樣回收率分別為100.70%、99.31%、101.10%、100.03%、99.63%（RSD均小于2%，n=9）。3批槐花散樣品中，上述5種成分的含量分別為20.055～22.615、25.557～27.806、11.428～13.250、0.350～0.478、2.372～4.011 mg/g。結(jié)論：所建含量測定方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于槐花散中5種成分的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞 槐花散;高效液相色譜波長切換法;蘆丁;柚皮苷;新橙皮苷;槲皮素;胡薄荷酮;含量測定

Simultaneous Determination of 5 Components in the Classical Formula Huaihua San by HPLC Wavelength Switching Method

XIANG Zedong1，XUE Qing1，YU Haitao2，SUN Zhiqiang2，LI Zhen1，LIU Juyan3，ZHANG Jiayu4，GAO Peng1， DAI Long4（1. College of Pharmacy， Shandong University of TCM， Jinan 250355， China; 2. Shandong Yuze Institute of Pharmaceutical and Health Industry Technology， Shandong Dezhou 251200， China; 3. Technology and Quality Department， Guangzhou Pharmaceutical Group Co.， Ltd， Guangzhou 510130， China; 4. School of Pharmacy， Binzhou Medical University， Shandong Yantai 264003， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of 5 components in classical formula Huaihua san， including rutin， naringin， neohesperidin， quercetin and pulegone. METHODS： HPLC wavelength switching method was adopted. The determination was performed on Cosmosil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 257 nm for rutin， 283 nm for naringin and neohesperidin， 254 nm for quercetin， 252 nm for pulegone， respectively. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range was 21.7-2 170 μg/mL for rutin， 46-4 600 μg/mL for naringin， 22.3-? ? ? 2 230 μg/mL for neohesperidin， 0.96-96 μg/mL for quercetin， 2.7-270 μg/mL for pulegone （all r>0.999）， respectively. RSDs of precision， stability （24 h） and reproducibility tests were all lower than 2% （n=6）. Average recoveries were 100.70%， 99.31%， 101.10%， 100.03% and 99.63% （all RSD<2%， n=9）. Among 3 batches of Huaihua san samples， the contents of above 5 components were? 20.055-22.615， 25.557-27.806， 11.428-13.250， 0.350-0.478， 2.372-4.011 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： Established method is simple， accurate and reproducible， and could be used for the simultaneous determination of 5 components in Huaihua san.

KEYWORDS? ?Huaihua san; HPLC wavelength switching method; Rutin; Naringin; Neohesperidin; Quercetin; Pulegone; Content determination

槐花散始載于宋代許叔微所著的《普濟(jì)本事方》，是治療腸風(fēng)臟毒的經(jīng)典方[1]。該方為《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第34方，具有清腸涼血止血、疏風(fēng)行氣的功效，主治風(fēng)熱濕毒、壅遏腸道、損傷血絡(luò)證，常用于潰瘍性結(jié)腸炎的臨床治療[2]。槐花散由槐花（炒）、側(cè)柏葉（爛杵焙）、荊芥穗、枳殼（去穰細(xì)切，麩炒）等4味藥材組成，依據(jù)文獻(xiàn)[3-6]和2020年版《中國藥典》（一部）[7]，該方主要含有黃酮類（如槐花所含的蘆丁和槲皮素、側(cè)柏葉所含的槲皮苷、枳殼所含的柚皮苷和新橙皮苷）和單萜類（如荊芥穗所含的胡薄荷酮）成分?，F(xiàn)代研究表明，上述6種成分均具有抗炎作用[8-11]。

目前，關(guān)于槐花散化學(xué)成分及質(zhì)量控制的研究較少，主要集中在黃酮類成分的分離純化、薄層鑒別和含量測定方面：例如，陳建真等[3]建立了AB-8大孔樹脂分離純化槐花散總黃酮的工藝;巨福星等[4]建立了槐花散中君藥槐花（炒）主要成分蘆丁的薄層鑒別法及其含量測定的高效液相色譜法（HPLC）?，F(xiàn)有關(guān)于槐花散質(zhì)量控制的研究僅以黃酮類成分作為指標(biāo)，而方中荊芥穗具有祛風(fēng)理血止血的功效，其主要成分胡薄荷酮具有薄荷香氣，能夠改善槐花散的氣味，且具有顯著的抗炎、止痛作用，也是該方的指標(biāo)成分之一[12-13]。可見，僅對(duì)總黃酮類成分或單一成分進(jìn)行控制已不能滿足槐花散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)日益提高的要求。多指標(biāo)成分的含量測定更符合中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)治療疾病的特點(diǎn)[5]，也是控制槐花散質(zhì)量的有效手段。雖然，吳笛等[6]利用HPLC技術(shù)，建立了同時(shí)測定槐花散中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素等4種黃酮類成分含量的方法，但其未對(duì)方中單萜類有效成分進(jìn)行測定;另外，該研究的檢測波長為283 nm，蘆丁、槲皮素等化學(xué)成分在該波長下不能達(dá)到最大吸收，檢測靈敏度低、誤差較大[14]。筆者在實(shí)驗(yàn)前期參考2020年版《中國藥典》（一部）和相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，槐花散中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮分別在257、283、283、254、252 nm波長處存在最大吸收[7，14]。基于此，本研究建立了同時(shí)測定槐花散方中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素和胡薄荷酮等5種成分（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)未能成功檢出槲皮苷）含量的HPLC波長切換法，旨在從整體層面有效控制槐花散的質(zhì)量，亦為其臨床安全有效應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Waters e2695型 HPLC儀（美國Waters司）、LC2030 型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、ME104E型萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DZKW-C型雙列六孔恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司）等。

1.2 藥品與試劑

蘆丁（批號(hào)Y16M9S61523，純度≥98%）、槲皮素（批號(hào)C01J10Y91727，純度≥98%）、胡薄荷酮（批號(hào)Y21F12Q138984，純度≥98%）對(duì)照品均購自上海源葉生物科技有限公司;柚皮苷（批號(hào)110722-201815，純度≥91.7%）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201804，純度≥99.4%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

槐花（批號(hào)分別為200601、200605、200702）、側(cè)柏葉（批號(hào)分別為200405、200406、200505）、荊芥穗（批號(hào)分別為200311、200202、200504）、枳殼（批號(hào)分別為200802、200807、200901）藥材均購自安徽省亳州市思遠(yuǎn)藥業(yè)銷售有限公司，經(jīng)原濟(jì)南市藥品檢驗(yàn)所宋希貴主任藥師鑒定，分別為豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾、柏科植物側(cè)柏Platycladus orientalis（L.）Franco的干燥枝梢和葉、唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuisfolia Briq.的干燥花穗、蕓香科植物酸橙Citrus? ? aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)。槐花炮制品按2020年版《中國藥典》（一部）槐花“炒槐花”項(xiàng)下方法制備;側(cè)柏葉炮制品按槐花散處方搗碎，并按2020年版《中國藥典》（四部）“0213炮制通則”清炒法炒至表面深黃色;枳殼炮制品按2020年版《中國藥典》（一部）枳殼“麩炒枳殼”項(xiàng)下方法制備;荊芥穗炮制品按2020年版《中國藥典》（一部）荊芥穗“飲片”項(xiàng)下方法制備[7，15]。上述炮制品均平行制備3批。將各批炮制品粉碎成細(xì)粉（過五號(hào)篩）后，按槐花散處方配制（各取細(xì)粉10 g，混合均勻），即得3批槐花散樣品（編號(hào)分別為201201、201202、201203），真空密封保存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Cosmosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，15%A;5～10 min，15%A→20%A;10～20 min，20%A;20～25 min，20%A→35%A;25～35 min，35%A→65%A;35～45 min，65%A→95%A）;檢測波長依次為257 nm（0～16 min，蘆?。?83 nm（16～27 min，柚皮苷、新橙皮苷）、254 nm（27～31 min，槲皮素）、252 nm（31～45 min，胡薄荷酮）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮對(duì)照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為200、500、200、10、30 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取槐花散樣品約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按槐花散處方要求，分別制備不含槐花、側(cè)柏葉、枳殼、荊芥穗的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（編號(hào)201201）和陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各待測成分色譜峰峰形較好且均已實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5;陰性對(duì)照對(duì)待測成分的測定無干擾，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

取干燥至恒定質(zhì)量的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮對(duì)照品各適量，精密稱定，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2 170、4 600、2 230、96、270 μg/mL的混合貯備液;取上述混合貯備液適量，用甲醇分別稀釋5、10、50、100倍，制得蘆丁質(zhì)量濃度分別為434、217、43.4、21.7 μg/mL、柚皮苷分別為920、460、92、46 μg/mL、新橙皮苷分別為446、223、44.6、22.3 μg/mL、槲皮素分別為19.2、9.6、1.92、0.96 μg/mL、胡薄荷酮分別為54、27、5.4、2.7 μg/mL的線性工作溶液。取上述貯備液和線性工作溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以各待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下相應(yīng)質(zhì)量濃度的線性工作溶液（蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮的質(zhì)量濃度分別為217、460、223、9.6、27 μg/mL）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為0.61%、1.19%、0.46%、0.41%、0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)201201）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為0.91%、1.78%、1.54%、1.36%、0.96%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取槐花散樣品（編號(hào)201201）6份，每份約0.25 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種待測成分的含量。結(jié)果，蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮的平均含量分別為20.058、27.806、13.165、0.475、2.766 mg/g，RSD分別為1.03%、1.02%、1.22%、0.54%、0.25%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量（蘆丁20.058 mg/g、柚皮苷27.806 mg/g、新橙皮苷13.165 mg/g、槲皮素0.475 mg/g、胡薄荷酮2.766 mg/g）的槐花散樣品（編號(hào)201201）約0.125 g，精密稱定，分別按已知量的0.8、1、1.2倍精密加入蘆?。?.512 4 mg/mL，4、5、6 mL）、柚皮苷（0.710 0 mg/mL，4、5、6 mL）、新橙皮苷（0.840 7 mg/mL，1.6、2、2.4 mL）、槲皮素（0.061 0 mg/mL，0.8、1、1.2 mL）、胡薄荷酮（0.353 2 mg/mL，0.8、1、1.2 mL）單一對(duì)照品溶液（按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 耐用性試驗(yàn)

精密稱取槐花散樣品（編號(hào)201201）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件以不同色譜儀（Waters e2695型、Shimadzu LC2030型HPLC儀）、不同色譜柱（Cosmasil C18、Kromasil C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種待測成分的含量。結(jié)果，改變上述色譜條件后，5種待測成分的色譜峰分離度均良好，含量的RSD均小于2.0%（n=3），表明方法耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取3批槐花散樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中5種待測成分的含量。每樣品平行操作3次，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取條件的確定

本課題組前期考察了不同提取溶劑、不同提取方法對(duì)槐花散中5種待測成分提取效果的影響。首先，采用甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇等4種不同溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取溶劑時(shí)，5種待測成分的提取效果明顯優(yōu)于其他3種溶劑。同時(shí)，本課題組還考察了超聲提取30、45、60 min以及加熱回流提取30、45、60 min的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流法的提取效果明顯優(yōu)于超聲法，尤以回流45 min時(shí)各成分的提取效果最優(yōu)，故選擇甲醇為提取溶劑，加熱回流提取45 min。

3.2 色譜條件的選擇

本課題組前期考察了以0.05%、0.1%、0.5%等不同濃度甲酸、磷酸溶液為水相時(shí)各成分的分離效果，結(jié)果顯示，各濃度磷酸溶液均能使5種待測成分完全分離，分離效果相似。同時(shí)，本課題組又考察了甲醇、乙腈為有機(jī)相對(duì)各成分分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，各成分色譜峰峰形良好，色譜柱柱壓低，為延長色譜柱的使用壽命，故選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相。由于槐花散中蘆丁等5種成分的極性差異較大，故采用梯度洗脫以保證在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)各成分含量的同時(shí)測定。本研究測定的5種待測成分主要為黃酮類和單萜類成分，最大吸收波長有較大差異，為準(zhǔn)確測定各成分含量，筆者參考2020年版《中國藥典》（一部）及相關(guān)文獻(xiàn)[7，14]，最終采用了波長切換法進(jìn)行測定。

3.3 含量測定結(jié)果分析

本研究同時(shí)測定了槐花散中5種成分的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槐花散中5種成分的平均含量從高到低為柚皮苷>蘆丁>新橙皮苷>胡薄荷酮>槲皮素。不同批次槐花散中各成分的含量差異較大，推測這可能與所用藥材的品質(zhì)和炮制的操作過程有關(guān)。因此，在槐花散生產(chǎn)過程中，應(yīng)注意投料藥材質(zhì)量的均一性和炮制過程的規(guī)范性，以保證槐花散的穩(wěn)定性和臨床用藥的安全性。本課題組前期考察了槐花散中槲皮苷的測定，但并未檢出，推測其在側(cè)柏葉炮制過程中因受熱而被破壞[6，16]，因此未選擇槲皮苷作為槐花散質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

本研究以經(jīng)典名方槐花散為對(duì)象，成功建立了同時(shí)測定槐花散中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素、胡薄荷酮等5種成分含量的HPLC波長切換法，該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為經(jīng)典名方槐花散的質(zhì)量控制和臨床安全用藥提供參考。

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（收稿日期：2021-03-11 修回日期：2021-06-11）

（編輯：陳 宏）