孔 萍，王康嶸，張 靜

(1.宜昌市夷陵醫(yī)院藥劑科，宜昌 443100；2.武漢市普仁醫(yī)院耳鼻喉口腔頭頸外科，武漢 430081)

惡性腫瘤是目前導(dǎo)致居民死亡的主要原因之一[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，抗原分化簇90(CD90)參與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程，可在各種正常組織或細(xì)胞中表達(dá)并與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[2]。腫瘤干細(xì)胞(CSCs)的存在是腫瘤逆轉(zhuǎn)和恢復(fù)的主要原因之一?？乖只?33(CD133)為CSCs標(biāo)志物，Notch為調(diào)控CSCs的經(jīng)典信號(hào)通路。研究表明，CD133和Notch1具有致瘤性，且與CSCs腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥有關(guān)[3-4]。研究證實(shí)，細(xì)胞自噬具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展的作用，通過抑制細(xì)胞自噬可達(dá)到抗腫瘤作用[5]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)為細(xì)胞自噬的重要調(diào)控途徑。雷帕霉素是目前臨床常用的mTOR受體抑制劑，可通過抑制mTOR活化，促進(jìn)細(xì)胞自噬[6]。本研究觀察了雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞和小鼠S180肉瘤模型的抑瘤作用，以及對(duì)腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討雷帕霉素的抗腫瘤作用機(jī)制，為臨床抗腫瘤治療提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Multiskan FC型酶標(biāo)儀和Attune NxT型流式細(xì)胞儀，均購自美國賽默飛世爾公司。

1.2材料 小鼠S180肉瘤細(xì)胞，上海江林生物科技有限公司；雷帕霉素(批號(hào)822178)，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DMEM完全培養(yǎng)基(批號(hào)31600)、磷酸鹽緩沖液(PBS，批號(hào)P1022)、胰蛋白酶(批號(hào)T1320)、CCK-8試劑盒(批號(hào)CA1210)、抗熒光衰減封片劑(批號(hào)S2100)、HRP標(biāo)記二抗(批號(hào)SE064)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)DA1015)，均購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(批號(hào)340242)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)556507)，均購自美國BD公司；冷凍包埋劑(批號(hào)6506)、熒光二抗(批號(hào)A-11034)，均購自美國賽默飛世爾公司；CD90多克隆抗體(批號(hào)ABP56393)、CD133多克隆抗體(批號(hào)ABP52923)、Notch1多克隆抗體(批號(hào)PAB19810)、β-actin多克隆抗體(批號(hào)ABP50593)，購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3動(dòng)物 KM小鼠(批號(hào)CS-003)，雄性，40只，6～8周齡，體質(zhì)量為(20.13±1.78) g，均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)20200002。

2 方法

2.1體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 在液氮中取出凍存細(xì)胞，置于37 ℃水浴鍋中融化，移至15 mL離心管中，加入預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基10 mL，以2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；以DMEM完全培養(yǎng)基10 mL清洗，棄上清液；再次加入DMEM完全培養(yǎng)基10 mL，接種于培養(yǎng)板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基；以PBS清洗2次，加入胰蛋白酶3 mL消化，3 min后以DMEM完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，移至15 mL離心管中，以2 000 r·min-1離心2 min，棄上清液；加入PBS 10 mL，吹勻后細(xì)胞以1×105個(gè)·孔-1接種于96孔板中，孵育過夜，雷帕霉素低、中、高劑量組分別加入20、50、100 nmol·L-1的雷帕霉素；對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；空白組僅加入等量培養(yǎng)液。

2.1.2細(xì)胞增殖 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。雷帕霉素分別作用24、48、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃避光孵育3 h；用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(A給藥組-A對(duì)照組)÷(A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

2.1.3細(xì)胞周期與凋亡 采用流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡。雷帕霉素作用48 h后，在4 ℃條件下，以3 000 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入預(yù)冷的PBS洗滌2次，以100 μL結(jié)合PBS重懸細(xì)胞；分別按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1模型構(gòu)建與分組 將S180肉瘤細(xì)胞以1×106個(gè)·mL-1接種于小鼠左前肢腋下皮下，24 h后隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組以及雷帕霉素低、中和高劑量組；定期測(cè)量小鼠體質(zhì)量和腫瘤長徑(a)、短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積V(mm3)，V=ab2÷2，當(dāng)V≥100 mm3時(shí)，按照人體臨床用量的0.5、1.0、2.0倍換算小鼠用量，雷帕霉素低、中和高劑量組小鼠分別以1、2、4 mg·kg-1雷帕霉素灌胃，對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃，每日1次，共3周。

2.2.2皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 末次灌胃后24 h，測(cè)定小鼠體質(zhì)量，以CO2吸入麻醉，剝?nèi)∧[瘤稱定質(zhì)量，記錄瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率，抑瘤率(%)=(對(duì)照組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量)÷對(duì)照組瘤質(zhì)量×100%。

2.2.3腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá) 取腫瘤組織，一部分保存于-70 ℃冰箱內(nèi)，用于免疫熒光染色；另一部分固定于甲醛中，用于免疫組織化學(xué)染色。(1)免疫熒光染色：取組織，用冷凍包埋劑包埋后，用切片機(jī)制備成厚8 μm的連續(xù)切片；4 ℃下丙酮固定10～20 min，用PBS沖洗3次，每次5 min；滴加正常羊血清，37 ℃反應(yīng)30 min；棄去多余血清，滴加一抗，4 ℃過夜；用PBS沖洗3次，每次5 min；滴加熒光素標(biāo)記二抗，37 ℃避光孵育60 min；PBS沖洗3次，每次5 min；以抗熒光衰減封片劑封片，400倍熒光顯微鏡觀察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白陽性信號(hào)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)綠光顆粒、細(xì)胞核出現(xiàn)藍(lán)光顆粒；計(jì)算染色強(qiáng)度，染色強(qiáng)度越大提示蛋白表達(dá)越強(qiáng)。(2)免疫組織化學(xué)染色：取組織，依次進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟處理后，以石蠟包埋，用切片機(jī)制備成厚4 μm的連續(xù)切片；烤片60 min，依次進(jìn)行脫蠟、水化，加入過氧化氫溶液滅活；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加抗原修復(fù)液，沸水浴中煮沸15 min，自然冷卻至室溫；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記二抗，37 ℃孵育60 min；PBS沖洗3次，每次5 min，滴加DAB顯色劑，3 min后用自來水沖洗，蘇木素復(fù)染3 min，分化液反應(yīng)30 s，反藍(lán)后用自來水沖洗；常規(guī)脫水、透明處理后，以中性樹膠封片，400倍顯微鏡下觀察并拍照；CD90、CD133和Notch1蛋白陽性信號(hào)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，計(jì)算灰度值，灰度值越高提示蛋白表達(dá)越弱。

3 結(jié)果

3.1雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞增殖的影響 見表1。由表1可知，與對(duì)照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)；同一作用時(shí)間，細(xì)胞增殖抑制率隨雷帕霉素濃度的增加而升高(P<0.05)。

表1 不同濃度雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率的影響

3.2雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞周期的影響 見表2。由表2可知，與對(duì)照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期阻滯明顯(P<0.05)，主要阻滯于G0/G1期。

表2 不同濃度雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞各細(xì)胞周期抑制率的影響

3.3雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 見圖1和表3。由圖1和表3可知，與對(duì)照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組作用S180肉瘤細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴性。

圖1 不同濃度雷帕霉素作用于S180肉瘤細(xì)胞的凋亡情況

表3 不同濃度雷帕霉素對(duì)S180肉瘤細(xì)胞凋亡率的影響

3.4雷帕霉素對(duì)S180肉瘤小鼠的抑瘤作用 見表4。由表4可知，實(shí)驗(yàn)前后，各組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，雷帕霉素低、中和高劑量組小鼠瘤質(zhì)量顯著降低，抑瘤率顯著升高(P<0.05)；瘤質(zhì)量隨雷帕霉素濃度的增加而降低，抑瘤率隨雷帕霉素濃度的增加而升高(P<0.05)。

表4 各組小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

3.5雷帕霉素對(duì)小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)的影響

3.5.1免疫熒光染色 見表5。由表5可知，與對(duì)照組比較，其他3組小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)顯著降低，隨雷帕霉素濃度增加而降低(P<0.05)。

表5 各組小鼠肉瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白免疫熒光染色結(jié)果比較

3.5.2免疫組織化學(xué)染色 見表6。由表6可知，與對(duì)照組比較，其他3組小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)顯著降低，隨雷帕霉素濃度增加而降低(P<0.01)。見表6。

表6 各組小鼠肉瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白免疫組化染色結(jié)果比較

4 討論

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅居民生命健康的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞自噬密切相關(guān)[7]。吳曉莉等[8]研究表明，自噬活性改變可導(dǎo)致正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。mTOR為誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的重要途徑[9]。雷帕霉素為新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，主治器官移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可與細(xì)胞內(nèi)受體FKBP-12結(jié)合形成復(fù)合物，抑制mTOR活性和誘導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)停滯在G1期[11]。宋魏等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過下調(diào)mTOR表達(dá)和mTOR磷酸化，降低mTOR信號(hào)通路活性，顯著抑制鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞增殖，達(dá)到抗腫瘤作用。

肉瘤源于小鼠間葉組織惡性腫瘤，常見于纖維肉瘤、骨肉瘤、淋巴肉瘤等[13]。崔明星等[14]以不同濃度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用于人骨肉瘤MG-63細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，作用3～5 d后細(xì)胞增殖能力顯著降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/mTOR信號(hào)通路，可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15]。本研究使用的小鼠S180肉瘤細(xì)胞來源于白人女性骨肉瘤組織，不同濃度雷帕霉素(20、50、100 nmol·L-1)作用后發(fā)現(xiàn)，S180肉瘤細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)，符合以往研究結(jié)果[16]，同一作用時(shí)間，細(xì)胞增殖抑制率隨雷帕霉素濃度的增加而升高，提示隨著雷帕霉素濃度的增加，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力可能越強(qiáng)。既往研究結(jié)果顯示，雷帕霉素可抑制高糖狀態(tài)下腎系膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡并使細(xì)胞阻滯于G1/S期[17]。周倫歡等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可通過抑制mTOR通路活性，將細(xì)胞阻滯于G1/G0期，抑制伯基特淋巴瘤細(xì)胞株增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素作用S180肉瘤細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期阻滯明顯，且主要阻滯于G0/G1期，雷帕霉素促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用呈濃度依賴性，符合以往研究結(jié)果。以上體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，雷帕霉素具有明顯的抗腫瘤作用，可能通過抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G1/G0期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。Shen M H等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能顯著降低腫瘤負(fù)荷。本研究通過構(gòu)建小鼠S180肉瘤皮下荷瘤模型發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可顯著降低小鼠瘤質(zhì)量，且瘤質(zhì)量隨雷帕霉素濃度的增加而降低，抑瘤率隨雷帕霉素濃度的增加而升高，符合以往研究結(jié)果，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)雷帕霉素具有明顯的抗腫瘤作用。CSCs是影響腫瘤形成、增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因素。Hubo Shi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素誘導(dǎo)的腫瘤生長延遲可能與抑制腫瘤干細(xì)胞表型Notch1、CD133和CD90蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究分別采用免疫熒光染色和免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織Notch1、CD133和CD90表達(dá)，結(jié)果均顯示，雷帕霉素可顯著抑制小鼠腫瘤組織CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)，且隨雷帕霉素濃度的增加而降低，符合以往研究結(jié)果。

綜上所述，雷帕霉素可能通過下調(diào)CD90、CD133和Notch1蛋白表達(dá)，影響S180肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，達(dá)到體內(nèi)外抑瘤作用。