王治會(huì)，彭華，岳翠男，李琛，李文金，江新鳳，楊普香*

（1.江西省蠶桑茶葉研究所/江西省茶葉質(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330202；2.江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所，江西 南昌 330202）

鉛山縣位于武夷山脈北麓，境內(nèi)南高北低，海拔相差2 104.9 m，山區(qū)丘陵密布，雨量充沛、霧日長(zhǎng)，自古以來(lái)盛產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶葉，被農(nóng)業(yè)部劃入國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)勢(shì)區(qū)域[1]。目前鉛山縣創(chuàng)建茶葉品牌19個(gè)，包括紅茶6個(gè)、綠茶12個(gè)、白茶1個(gè)，“河紅茶”為其重要代表，產(chǎn)于“萬(wàn)里茶道第一鎮(zhèn)”河口鎮(zhèn)[2]。在《中國(guó)通史》中記載“鉛山河紅茶乃國(guó)內(nèi)著名紅茶”和“第一次問(wèn)世（出口）之華茶”，被西方奉為“至尊名茶”與“茶中皇后”，其品質(zhì)特征條索緊細(xì)，烏潤(rùn)顯毫，香氣清鮮持久，滋味甘醇鮮爽，湯色紅艷[3]。產(chǎn)生其特征性品質(zhì)的一個(gè)重要因素就是鉛山群體種，該品種是本區(qū)域的主栽茶樹(shù)品種，適應(yīng)性強(qiáng)，制茶品質(zhì)優(yōu)異，且經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然雜交與變異，形成了一個(gè)天然茶樹(shù)種質(zhì)庫(kù)，極具開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。茶葉生化成分與其品質(zhì)和功能等息息相關(guān)[4-5]，研究其生化成分特征特性有助于人們明確其資源特征，對(duì)進(jìn)一步改善茶葉品質(zhì)，選育各區(qū)域生態(tài)經(jīng)濟(jì)型品種以及挖掘其深加工利用價(jià)值等具有重要意義。

目前，我國(guó)各茶區(qū)茶樹(shù)資源生化特性的研究在不斷深入，張金霞等[6]對(duì)黃山群體種的主要生化成分進(jìn)行分析，篩選出了7份適制紅茶、15份適制綠茶、6份適制烏龍茶的種質(zhì)。莫嵐等[7]對(duì)金秀野生群體的兒茶素及氨基酸組分進(jìn)行分析，為其區(qū)域茶產(chǎn)品與深加工的開(kāi)發(fā)提供了參考。宋勤飛等[8]對(duì)久安古茶樹(shù)的生化成分進(jìn)行分析，篩選出了6份高茶多酚資源。林小瑞等[9]研究不同資源的兒茶素的變化，對(duì)烏龍茶加工工藝的改良提供了基礎(chǔ)。這些研究的側(cè)重點(diǎn)在于發(fā)掘特異茶樹(shù)種質(zhì)資源，而缺少關(guān)于種群生化特性的遺傳變異及多樣性的探討，關(guān)于鉛山群體種生化品質(zhì)多樣性及其特征特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此不能準(zhǔn)確有效的發(fā)掘與利用該資源。本研究在江西省茶樹(shù)種質(zhì)資源收集與創(chuàng)新利用的基礎(chǔ)之上，擬對(duì)鉛山群體種的28份單株春梢生化成分含量進(jìn)行鑒定，明確其多樣性及品質(zhì)特性，從中篩選出優(yōu)良單株與特異種質(zhì)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用鉛山群體種資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

2014年江西省蠶桑茶葉研究所科研人員從鉛山縣各區(qū)縣的群體種中收集實(shí)生苗單株，保存于試驗(yàn)基地內(nèi)，2018年～2019年隨機(jī)從實(shí)生苗單株中采摘28份單株的春梢生化成分進(jìn)行檢測(cè)分析。采摘各單株越冬芽第一輪新梢一芽二葉進(jìn)行微波固樣，制作生化樣品用于分析?？Х葔A、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin gallate，CG）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、兒茶素（catechin，C），此9份標(biāo)準(zhǔn)品純度均為98%：成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國(guó)賽默飛世爾公司；高效液相色譜儀（1100VL）：美國(guó)安捷倫有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2550）：日本島津儀器有限公司；電子天平（ME104）：賽多利斯科學(xué)儀器（上海）有限公司；離心機(jī)（TG16-WS）：常州金壇良友儀器有限公司。

1.3 方法

兒茶素組分（ECG、EC、GCG、GC、EGCG、C、EGC）、GA、咖啡堿含量測(cè)定：采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，色譜柱采用Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A為0.3%冰乙酸溶液；流動(dòng)相B為純乙腈。流動(dòng)相A的梯度變化：0～5 min為95%～92%，5 min～15 min為92%～88%，15 min～30 min 為 88%～80%，30 min～31 min 為88%～0%，31min～35min為0%；流動(dòng)相B的梯度與A的梯度對(duì)應(yīng)；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm。

水分測(cè)定：采用減重法；水浸出物含量測(cè)定：采用GB/T 8305—2013《茶水浸出物測(cè)定》方法；游離氨基酸含量測(cè)定：采用GB/T 8314—2013《茶游離氨基酸總量測(cè)定》方法；茶多酚含量測(cè)定：采用GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》方法；各個(gè)生化成分測(cè)定每個(gè)茶樣重復(fù)3次。酚氨比為茶多酚與氨基酸的比值；總兒茶素為各兒茶素單體之和。

兒茶素品質(zhì)指數(shù)分析方法[6-7]：兒茶素品質(zhì)指數(shù)=（EGCG含量+ECG含量）/ECG含量×100；兒茶素苦澀味指數(shù)=（EGCG含量+ECG含量+EGC含量+GC含量）/（EC含量+C含量）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

生化成分的Shannon—Weaver多樣性指數(shù)計(jì)算公式為 H′=-ΣPi×lnPi，Pi是某生化成分第 i個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的頻率，級(jí)別劃分利用標(biāo)準(zhǔn)差和平均數(shù)分為10級(jí)：第1級(jí)為 X1<（X-2a）、第 10級(jí)為 X10≥（X+2a），X 為各生化成分的平均數(shù)，a為各生化成分的標(biāo)準(zhǔn)差，每0.5a為1級(jí)。聚類分析采用SPSS19.0，熱圖分析采用Multiple Experiment Viewer 4.9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化成分熱圖描述與多樣性分析

28份鉛山群體種單株的生化成分熱圖分析和多樣性分析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各單株生化成分熱圖分析Fig.1 Thermogram analysis of biochemical components of each individual plant

從熱圖的顏色差異和多樣性指數(shù)來(lái)看，熱圖中每一個(gè)生化成分的顏色均不完全一致，存在較大差異，不同生化成分之間的顏色差異性不同，與多樣性指數(shù)的大小保持一致。鉛山群體種單株的生化成分多樣性指數(shù)范圍為1.44～2.04，平均值為1.83，大小依次為EC>酚氨比>非酯型兒茶素>酯型兒茶素>茶多酚=GC>EGC>EGCG=總兒茶素>水浸出物>ECG>咖啡堿>游離氨基酸>GCG>C>GA。江西省內(nèi)種質(zhì)資源生化成分多樣性指數(shù)范圍為1.25～2.11，平均值為1.91[10]。說(shuō)明鉛山群體種的多樣性與整個(gè)江西省內(nèi)茶樹(shù)資源的多樣性相比稍低，原因在于江西省的茶樹(shù)資源包括省外引種、省內(nèi)群體、野生等原生種質(zhì)，所以多樣性程度較高，而鉛山群體種的多樣性主要來(lái)源于群體內(nèi)的自然雜交，但與黃山群體種（1.78）[6]等相比較，其多樣性相對(duì)豐富，具備篩選出優(yōu)良資源的潛力。

水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿是影響茶葉品質(zhì)的重要代謝物質(zhì)[11-13]。鉛山群體種的水浸出物含量范圍為41.60%～47.72%，均值為45.29%，多樣性指數(shù)為1.85，從熱圖中可以看出高于均值的有16份；茶多酚含量的范圍為12.83%～23.07%，均值為17.79%，多樣性指數(shù)為1.93，各單株含量差異性較大；游離氨基酸含量的范圍為2.77%～5.16%，均值為3.70%，多樣性指數(shù)為1.69，高于均值的有13份；咖啡堿含量的范圍為3.22%～4.94%，均值為4.13%，多樣性指數(shù)為1.72，低于均值的有14份。從4個(gè)成分含量均值來(lái)看，與其它茶葉內(nèi)4個(gè)常規(guī)成分含量的范圍[10]比較，鉛山群體種的水浸出物、游離氨基酸含量較高，茶多酚含量較低，咖啡堿含量中等，說(shuō)明鉛山群體種具備優(yōu)良制茶品質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ)。多樣性指數(shù)中茶多酚最高、其次為水浸出物，說(shuō)明鉛山群體種在自然雜交過(guò)程中，茶多酚和水浸出物的變動(dòng)較大，游離氨基酸和咖啡堿相對(duì)穩(wěn)定。

酚氨比是茶多酚與氨基酸的比值，其值能夠在一定程度上體現(xiàn)茶樹(shù)資源的適制性，值高的適制紅茶，值低的適制綠茶[14]。鉛山群體種春梢的酚氨比范圍為3.12～7.45，多樣性指數(shù)為2.01，多樣性指數(shù)較高，從熱圖顏色差異上也可看出各單株之間差異性較大，說(shuō)明鉛山群體種各單株酚氨比的多樣性較豐富，能夠適制不同的茶類。

兒茶素是茶湯滋味的基本貢獻(xiàn)物質(zhì)[4，15]，在紅茶制作中，兒茶素可轉(zhuǎn)化為茶黃素、茶紅素和茶褐素，進(jìn)而決定紅茶的品質(zhì)[16-17]。鉛山群體種的總兒茶素含量范圍為9.17%～17.11%，均值為13.17%，多樣性指數(shù)為1.90，在各單株中兒茶素含量的差異性較大，說(shuō)明可開(kāi)發(fā)改良利用的潛力較大。

2.2 聚類分析

對(duì)28份鉛山群體種單株生化成分含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。在距離為10的時(shí)候，可將28份單株分為5類，每一類均含有不同的亞組，各類的生化成分含量平均值見(jiàn)表1。

圖2 聚類分析系譜圖Fig.2 Cluster analysis pedigree

表1 各類生化成分比較Table 1 Comparison of various biochemical components

由圖2可知，第一類包括7個(gè)單株，分別為No.2、No.3、No.8、No.15、No.21、No.22 和 No.5，此類單株特征為游離氨基酸含量最低、酚氨比、非酯型兒茶素含量最高；第二類包括2個(gè)單株，分別為No.14和No.16，此類單株特征為總兒茶素、酯型兒茶素含量最低；第三類包括3個(gè)單株，分別為No.10、No.11和No.6，此類單株特征為水浸出物、茶多酚含量最低，酚氨比最低，游離氨基酸、咖啡堿含量最高；第四類包括10個(gè)單株，分別為No.24、No.27、No.1、No.19、No.17、No.23、No.12、No.25、No.26和No.9，此類單株特征為各項(xiàng)生化成分含量均處于中等水平；第五類包括6個(gè)單株，分別為No.4、No.13、No.18、No.28、No.7和No.20，此類單株特征為水浸出物、茶多酚、總兒茶素含量最高。

2.3 兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)分析

兒茶素品質(zhì)指數(shù)是衡量茶葉品質(zhì)及評(píng)價(jià)茶葉功效的一個(gè)經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，指數(shù)越大，說(shuō)明鮮葉的嫩度與品質(zhì)越好，兒茶素苦澀味指數(shù)是酯型兒茶素與簡(jiǎn)單兒茶素的比值，指數(shù)越大，說(shuō)明鮮葉的苦澀味越重[6-7]。以福鼎大白茶為對(duì)照，采用此兩項(xiàng)指標(biāo)能夠初步對(duì)鉛山群體種單株鮮葉的品質(zhì)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，各單株兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)的結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各單株的兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)Fig 3 Catechin quality and bitterness index of each individual plant

由圖3可知，各單株的兒茶素品質(zhì)指數(shù)比福鼎大白茶高的有7份，苦澀味指數(shù)比福鼎大白茶低的有19份。單株中既能滿足兒茶素品質(zhì)指數(shù)高，又能滿足苦澀味指數(shù)低的單株有4份，分別為No.3、No.5、No.17和No.18，說(shuō)明此4份單株鮮葉的兒茶素品質(zhì)高、苦澀味低，初步判定為優(yōu)良茶樹(shù)單株，結(jié)合此4份單株的酚氨比來(lái)判斷其適制性。傳統(tǒng)認(rèn)為酚氨比小于8適制綠茶，8～15之間為紅綠茶兼制，大于15適制紅茶，此劃分依據(jù)的茶多酚檢測(cè)方法為酒石酸亞鐵法，而GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》福林酚比色法測(cè)的茶多酚含量比酒石酸亞鐵法檢測(cè)的降低約30%左右，所以酚氨比劃分應(yīng)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整[18-19]。本研究認(rèn)為，采用福林酚比色法檢測(cè)茶多酚含量的以酚氨比小于6適制綠茶，6～10為紅綠茶兼制，大于10適制紅茶較為實(shí)際，結(jié)合圖1中酚氨比初步判斷，No.5和No.3為紅綠茶兼制，No.17和No.18適制綠茶。

2.4 特異單株篩選

隨著人們對(duì)于茶葉藥理功能的研究不斷深入，以及消費(fèi)更加多元化，篩選出適應(yīng)加工多樣化茶葉產(chǎn)品或能夠滿足深加工利用的特異性茶樹(shù)資源是今后的重點(diǎn)方向[20]。依據(jù)對(duì)鉛山群體單株常規(guī)生化成分的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出的生化成分特異的單株見(jiàn)表2。

表2 生化成分含量特異的單株Table 2 Single plant with specific biochemical component

由表2可知，從鉛山群體種中可篩選出了5份高水浸出物單株、1份高游離氨基酸單株、1份高兒茶素單株、6份低茶多酚單株。

3 結(jié)論

本研究對(duì)28份鉛山群體種單株的16項(xiàng)主要生化成分進(jìn)行分析，其多樣性指數(shù)范圍為1.44～2.04，均值為1.83，各成分多樣性指數(shù)大小依次為EC>酚氨比>非酯型兒茶素>酯型兒茶素>茶多酚=GC>EGC>EGCG=總兒茶素>水浸出物>ECG>咖啡堿>游離氨基酸>GCG>C>GA，由此可以看出鉛山群體種在自然雜交與自然變異過(guò)程中形成了豐富的生化成分多樣性，其中以茶多酚類物質(zhì)（非酯型兒茶素、酯型兒茶素）多樣性為主，茶多酚類物質(zhì)對(duì)茶葉的適制性具有決定性作用，說(shuō)明了鉛山群體種可開(kāi)發(fā)與可改良潛力較大。聚類分析將28份單株分為5類，明確了各類單株的典型生化特征，在利用這些單株時(shí)，可根據(jù)其典型生化特征發(fā)揮其資源優(yōu)勢(shì)。依據(jù)兒茶素品質(zhì)與苦澀味指數(shù)篩選出了兒茶素品質(zhì)高、苦澀味低的4份單株，初步判定其為優(yōu)良茶樹(shù)單株，通過(guò)酚氨比值來(lái)看，2份為紅綠茶兼制，2份為適制綠茶，鉛山縣茶產(chǎn)品以紅茶和綠茶為主，茶樹(shù)品種對(duì)茶產(chǎn)品的特色品質(zhì)具有決定性作用，因此培育出適合制作紅茶和綠茶的鉛山區(qū)域性茶樹(shù)新品種對(duì)其茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用，進(jìn)一步的工作將對(duì)此4份單株進(jìn)行擴(kuò)繁，形成系列新品系，全面測(cè)定其性狀指標(biāo)，探索其形成優(yōu)良品種的可能性。通過(guò)對(duì)比茶葉常規(guī)生化成分含量范圍，從鉛山群體種中篩選出了5份高水浸出物、1份高游離氨基酸、1份高兒茶素、6份低茶多酚特異資源，特異資源的應(yīng)用價(jià)值較大，可作為功能型和深加工專用型茶樹(shù)品種培育，如高氨基酸、高兒茶素等茶樹(shù)品種，也可作為茶樹(shù)遺傳改良的基礎(chǔ)性材料（如作為雜交親本）或探索其特異性成分的功能基因。