廖娜 黃光偉 唐紅艷 周傳檢 楊衛(wèi)豪 王恒山

摘 要： 為觀察大血藤醇提物抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性，該文采用75%乙醇提取制備大血藤醇提物（AESC），利用HPLC法測定其綠原酸含量;KM鼠（或新西蘭兔）在測定抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性時隨機分為空白對照組、陽性對照組（云南白藥酊組）、AESC組，依次測定其抑制二甲苯致小鼠耳腫脹度作用、痛閾值和兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血的記分分值，分別考察其抗炎、鎮(zhèn)痛、止血作用。結(jié)果表明：AESC中綠原酸含量為（0.294 ± 0.013 5）%;與空白組比較，劑量為0.700 g·kg-1 的AESC組能顯著減輕二甲苯所致的小鼠耳腫脹度（P<0.01），抑制率達26.3%;與空白組及給藥前比較，劑量為1.40 g·kg-1 的AESC組均能顯著提高小鼠痛閾值（P<0.01）;與空白組相比，劑量為1.40 g·kg-1的 AESC組能顯著提高兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血的記分分值（P<0.001）。大血藤醇提取物具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血作用，有望將其開發(fā)為抗炎、鎮(zhèn)痛、止血制劑。該結(jié)果也為大血藤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 大血藤， 抗炎活性， 鎮(zhèn)痛活性， 止血活性， 綠原酸

中圖分類號： Q946; R932 ?文獻標(biāo)識碼： A ?文章編號： 1000-3142（2021）07-1120-06

Abstract： To investigate the anti-inflammatory， analgesia and hemostasis effects of the 75% alcohol extract from Sargentodoxa cuneata （AESC）. The AESC was prepared by ethanol extraction， and its chlorogenic acid content was determined by HPLC. KM mice （or New Zealand rabbits） were randomly divided into the blank group， positive control group （Yunnan Baiyao Tincture group） and the AESC group in determination of anti-inflammatory， analgesia and hemostasis activities. The anti-inflammatory， analgesic and hemostasis effects were investigated through determining xylene-induced ear swelling of mice， pain threshold and rabbit liver bleeding model. The results were as follows： The content of chlorogenic acid was （0.294 ± 0.013 5）%; Compared with the blank group， AESC group （Dose 0.700 g·kg-1） could significantly reduce the ear swelling induced by xylene （P < 0.01）， and the inhibition rate was 26.3%; Compared with the blank group and before administration， AESC group （Dose 1.40 g·kg-1） could significantly increase the pain threshold of mice （P<0.01）; Compared with the blank group， AESC group （Dose 1.40 g·kg-1） could significantly improve the score of local wound bleeding （P<0.001）. The alcohol extracts of S. cuneata showed significant effects in anti-inflammatory， analgesic and hemostasis， could be developed as the anti-inflammatory， analgesic， hemostatic agents. And this study will provides theoretical basis for clinical application of the S. cuneata.

Key words： Sargentodoxa cuneata， anti-inflammatory activity， analgesia activity， hemostasis activity， chlorogenic acid

大血藤（Sargentodoxa cuneata）為木通科（Lardizabalaceae）大血藤屬（Sargentodoxa）植物。據(jù)2015年版《中國藥典》記載，大血藤具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)止痛等功效。近年來，大血藤水提物（李華等，2013）、乙酸乙酯部位（陳香君等，2017）、多糖（Guo et al.， 2018）等組分均具有抗炎作用。大血藤化學(xué)成分3，4-二羥基苯乙醇苷對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎具有保護作用（Li et al.， 2019）。大血藤水提物能抑制二甲苯引起小鼠耳廓腫脹，減輕腫脹度和腫脹率而具有抗炎作用;延長醋酸致疼痛模型小鼠痛閾潛伏期和減少扭體次數(shù)，抑制小鼠肉芽組織增生而具有鎮(zhèn)痛作用（李華等，2013）。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要集中在大血藤水提物、乙酸乙酯部位等的抗炎作用研究。大血藤不僅是風(fēng)濕痹痛特效藥，還具有治療腸癰腹痛、熱毒瘡瘍、經(jīng)閉、痛經(jīng)、崩漏、跌撲腫痛等作用。據(jù)文獻記載，大血藤服用方法有煎湯、研末、浸酒。本課題組認為，不僅大血藤的水提物具有抗炎活性，其醇提物在抗炎、鎮(zhèn)痛和止血方面也具有一定的開發(fā)前景。因此，本研究以大血藤醇提物（AESC）為研究對象，采用二甲苯致炎的小鼠耳腫脹度模型，熱板法及兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血模型，初步評價其醇提物抗炎、鎮(zhèn)痛、止血藥理活性，并建立HPLC法測定其中綠原酸含量，為開發(fā)大血藤抗炎、鎮(zhèn)痛、止血制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材及動物 大血藤的干燥藤莖，產(chǎn)地為湖北，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)張琴副教授鑒定。SPF級昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各30只，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXK桂2014～0002）;健康新西蘭兔，普通級，體重2.0～2.5 kg，由廣西廣得生物科技有限公司提供（許可證號：SCXK桂2017～0001）。動物實驗獲得了廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會的批準。

1.1.2 試劑和儀器 試劑：云南白藥酊（云南白藥集團股份有限公司生產(chǎn)，批號ZFE1703）;綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753-201716）;乙腈（Fisher），磷酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），均是色譜純。

儀器：FA1004型電子分析天平（上海精科天平廠）;GJ-8402型熱板測痛儀（寧海白石電子醫(yī)藥儀器廠）;Agilent 1200 VWD 液相色譜儀;梅特勒托利多ML204 電子天平。

1.2 方法

1.2.1 AESC的制備 大血藤藥材，粉碎，稱取300.0 g，液料比1∶10，溫度為80 ℃，75%乙醇回流提取，過濾，濃縮，重復(fù)提取2次，將提取液濃縮至無醇味，冷凍干燥，用10%乙醇溶解，備用。

1.2.2 AESC中綠原酸含量測定

1.2.2.1供試品和對照品溶液的制備 精密稱定AESC，于錐形瓶中用少量甲醇溶解，移入50 mL容量瓶，用甲醇定容，搖勻，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得供試品溶液;精密稱取6.3 mg綠原酸對照品，溶解，移入50 mL容量瓶，定容得126 μg·mL-1的綠原酸母液。

1.2.2.2 色譜條件 液相色譜條件：Kromasil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）;紫外檢測器波長325 nm; 進樣量20 μL; 流量1 mL·min-1; 柱溫30 ℃; 流動相為0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脫[15%→18%（B），0～10 min;18%→20% （B），10～15 min。]

1.2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取上述配制的綠原酸母液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL依次置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，并依照“1.2.2.2”色譜條件測定。

1.2.2.4 綠原酸含量測定方法學(xué)考察 取同一批號的供試品6份，精密稱定，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，制備供試品溶液，按“1.2.2.2”色譜條件實驗，測定樣品中綠原酸的含量相對標(biāo)準偏差（RSD），考察重復(fù)性;取濃度18.9 μg·mL-1的對照品溶液，按“1.2.2.2”色譜條件連續(xù)測定6次，計算峰面積RSD值，考察精密度;取同一批號的供試品，精密稱定，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，制備供試品溶液，于0、2、4、6、8 h按“1.2.2.2”色譜條件測定含量，共測5次，考察穩(wěn)定性;精密稱取已知綠原酸含量的供試品，共取6份，置10 mL容量瓶中，精密加入綠原酸對照品，定容于10 mL容量瓶。按“1.2.2.2”色譜方法測定回收率。

1.2.2.5 AESC中綠原酸含量測定 依次精密吸取3份供試品溶液20 μL，按“1.2.2.2” 色譜條件進樣，根據(jù)繪制的線性方程計算AESC中的綠原酸的含量。

1.2.3 藥理活性研究

1.2.3.1 抗炎作用研究 參照文獻（Chen et al.， 2019;Li et al.， 2020;梁天堅等，2020）的方法，略有改進。選取體重18～22 g健康昆明種雄性小鼠30只，每組10只，隨機分3組，設(shè)定空白組（溶劑組）、云南白藥酊組、AESC組。在小鼠右耳廓內(nèi)外兩面均勻涂抹100 μL二甲苯，左耳不涂。30 min后，各組小鼠右耳涂抹給藥，空白對照組給予5.00 g·kg-1溶劑，陽性對照組給予5.00 g·kg-1云南白藥酊，AESC組給予0.700 g·kg-1 AESC。1 h后，處死小鼠，清理左右耳，剪下左右耳廓，打孔，依次稱重，并按式（1）和式（2）計算腫脹度及腫脹抑制率。

腫脹度（mg）=右耳耳片質(zhì)量-左耳耳片質(zhì)量（1）

抑制率（%）=

（空白組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）空白組平均腫脹度×100（2）

1.2.3.2 鎮(zhèn)痛作用研究 采用略微改良的熱板法 （曹玫等，2013;Yuan et al.， 2019;Li et al.， 2020），（55 ± 0.1） ℃熱板，以小鼠自投熱板至舔后足所需時間作為痛閾值。選取小鼠的痛閾值在5～30 s之間，體重18～22 g健康昆明種雌性小鼠30只，隨機分3組，每組10只，依次設(shè)定為空白組（溶劑組）、云南白藥酊組、AESC組，測定小鼠給藥前的正常痛閾值2次。隨后，空白對照組給予5.00 g·kg-1溶劑，陽性對照組給予5.00 g·kg-1云南白藥酊，AESC組給予1.40 g·kg-1 AESC涂敷于每只動物的4個足跖，依次在15、30、45 min測定小鼠的痛閾值。

1.2.3.3 止血作用研究 參照文獻（Chen et al.， 2016; Shefa et al.， 2019; Wei et al.， 2020）的方法進行實驗。取健康體重為2.0～2.5 kg新西蘭兔15只，雌雄兼用，隨機分為3 組，設(shè)定為空白對照組（5.00 g·kg-1溶劑）、云南白藥酊組（5.00 g·kg-1）、AESC組（1.40 g·kg-1）。以30 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，消毒，開腹，在肝左葉制作長、寬、高均約1 cm創(chuàng)口，擦去噴出的血后，樣品涂于紗布上涂敷于創(chuàng)口上給藥，每30 s觀察1次，記錄時間，如超過3 min仍然出血，則記為未能止血，止血時間記為>3 min。每只動物進行4次肝臟局部創(chuàng)面損傷止血實驗。3個樣品按拉丁方程序敷藥，每個樣品總計進行20次止血實驗。止血效果按倒數(shù)計分法（10/T）記為分值F，3 min以上未能止血，F(xiàn)無分值記為0。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 20軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以x ± s表示，組間均數(shù)比較采用t 檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AESC中綠原酸含量測定

2.1.1 綠原酸標(biāo)準曲線 在“1.2.2.2”色譜條件下，標(biāo)準品和AESC樣品中綠原酸峰形和分離度較好，且色譜峰保留時間一致。以濃度（μg·mL-1）-峰面積進行線性回歸，求得回歸方程：y=28.556 2x-5.154 4，r=0.999 7。綠原酸在1.26～31.5 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2 綠原酸含量測定方法學(xué)考察 按“1.2.2.2”色譜條件進行平行實驗，測定取同一批號的6份供試樣品，其RSD為0.34%，這表明本實驗方法重復(fù)性良好。連續(xù)測定6次標(biāo)準品，RSD為0.63%，這表明儀器精密度良好。于0、2、4、6、8 h測定的綠原酸含量RSD為0.12%，這表明綠原酸日內(nèi)穩(wěn)定性良好。綠原酸的加標(biāo)回收率為95.42%，RSD值為1.60%，該結(jié)果顯示本實驗方法的回收結(jié)果準確可靠。

2.1.3 AESC中綠原酸含量 按“1.2.2.2”色譜條件進樣，并根據(jù)繪制的線性方程計算AESC樣品中的綠原酸的含量，含量為（0.294±0.013 5）%。

2.2 藥理實驗結(jié)果

2.2.1 抗炎實驗結(jié)果 由表1可知，與空白組比較，AESC劑量組能顯著減輕二甲苯所致的小鼠耳腫脹度（P<0.01），抑制率為26.3%，與陽性對照云南白藥酊組抑制率（26.9%）相當(dāng)。結(jié)果表明，AESC組具有極顯著的抗炎作用。

2.2.2 鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果 由表2可知，與空白組比較，在給藥15、30、45 min時，AESC能極顯著提高小鼠痛閾值（P<0.01）;與給藥前比較，AESC能顯著提高小鼠痛閾值（P<0.01）。結(jié)果表明AESC組具有極顯著的鎮(zhèn)痛作用。

2.2.3 止血實驗結(jié)果 由表3可知，與空白組比較，AESC對兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血有極顯著的止血效果（P<0.001），表明AESC具有極顯著的止血作用。

3 討論與結(jié)論

大血藤具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)止痛等功效，其藥材質(zhì)量控制受到廣泛關(guān)注。然而，目前大血藤醇提物質(zhì)量控制方法研究較少。本研究建立的大血藤醇提物中綠原酸的HPLC測定方法，該方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好，可用于大血藤醇提取物綠原酸的含量測定。綠原酸是大血藤藥材的重要指標(biāo)成分（Li et al.， 2016），是多種植物中的抗炎功效成分（Torres-rêgo et al.， 2016; Huang et al.， 2017; Chen et al.， 2017）。因此，通過測定大血藤醇提物中綠原酸的含量，用于其質(zhì)量控制，為開發(fā)利用大血藤提供理論依據(jù)。

本實驗通過測定二甲苯致小鼠耳腫脹度和痛閾值，考察大血藤醇提物抗炎和鎮(zhèn)痛活性。實驗結(jié)果表明，大血藤醇提物能顯著減輕二甲苯所致的小鼠耳腫脹度;與空白組及給藥前比較，其均能顯著提高小鼠痛閾值。本研究結(jié)果表明大血藤醇提物具有與云南白藥酊相當(dāng)?shù)目寡缀玩?zhèn)痛作用，這為AESC民間采用浸酒法用于祛風(fēng)止痛、痛經(jīng)、跌撲腫痛提供理論依據(jù)。本實驗測定了兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血的止血時間，結(jié)果顯示，與空白組相比，AESC能顯著提高兔肝臟局部創(chuàng)面損傷出血的記分分值，顯示AESC具有極顯著的止血活性。這為AESC民間用于崩漏提供了理論依據(jù)，也為其在臨床上用于治療子宮內(nèi)膜異位癥和慢性盆腔炎（何苗，2017;鄭亞玲，2010）提供了理論指導(dǎo)。大血藤醇提物有望開發(fā)成類似云南白藥的跌打損傷藥，或是具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性的口腔護理用品（Kharaeva et al.， 2020）。然而，大血藤的鎮(zhèn)痛、止血活性功效物質(zhì)基礎(chǔ)及其相應(yīng)的作用機制尚未明確，仍需深入研究。

綜上所述，大血藤醇提物具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血活性。本研究建立了AESC的質(zhì)量控制方法，優(yōu)化了提取工藝，有望開發(fā)成抗炎、鎮(zhèn)痛、止血制劑。

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注： ### 表示與空白對照組比較，記分分值差異極顯著。

Note： ### represents extremely significant differences in scores compared with blank group （P<0.001）.

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（責(zé)任編輯 何永艷）