基于響應(yīng)面設(shè)計(jì)的狹果茶藨子果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

吉正梅，葉英，2*，姜文，王樹林，曹效海，韓麗娟

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

狹果茶藨子（Ribes stenocarpum Maxim.）又名長果醋栗，與黑果茶藨（黑加侖）同屬虎耳草科茶藨屬（Ribes L.）漿果植物[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)茶藨屬植物全世界有160多種，我國約50余種，青海、西藏、甘肅、陜西、云南、四川等地均有分布[2]，其中青海省有11種1個(gè)變種[3]。狹果茶藨子果實(shí)味酸、性溫，具有解毒功能，種子富含亞油酸，具有軟化血管、防治動(dòng)脈硬化等功效[4]。其果實(shí)營養(yǎng)豐富，含有豐富的糖類、氨基酸等多種元素[5-7]，是制作果汁、果酒、果醬等的佳品。

我國茶藨子資源豐富[8]，種類較多，但尚未進(jìn)行有效開發(fā)利用，研究進(jìn)展緩慢，已有的文獻(xiàn)報(bào)道也是屈指可數(shù)。何可群等[6]研究了貴州亨利茶藨子中化學(xué)成分的提取與分離方法，并對(duì)茶藨子粗提物進(jìn)行了抗菌活性研究；袁鳳蓮[7]對(duì)新疆茶藨子的茶產(chǎn)品加工工藝進(jìn)行了報(bào)道；賈健輝等[9]對(duì)東北茶藨子復(fù)合飲料制備工藝進(jìn)行了研究；李靜等[10]發(fā)現(xiàn)五裂茶藨子葉中黃酮類化合物可抑制炎癥因子；葉英等[11]對(duì)青藏高原狹果茶藨子粗提物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抑菌活性及抗疲勞活性。狹果茶藨子發(fā)酵性能良好，在前期研究中發(fā)現(xiàn)，狹果茶藨子鮮果在一定條件下放置一段時(shí)間后可自行發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特的酒香味，具有加工成優(yōu)質(zhì)果酒的潛力。

果酒是水果經(jīng)發(fā)酵制成的低度飲料酒，主要成分除乙醇外，還富含還原糖、氨基酸、維生素及多酚類等營養(yǎng)物質(zhì)[12]。果酒具有抗氧化[13]、激發(fā)肝功能的功效[14]，還有利于情緒的調(diào)節(jié)[15]，飲用適量果酒可促進(jìn)機(jī)體血液循環(huán)和新陳代謝[16]。陳玲等[17]研究表明枸杞果酒中富含多種生物活性成分，具有清除自由基、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等功能；孫曉偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)黑加侖果酒中富含氨基酸和礦質(zhì)元素等，具有控制糖尿病、改善血液循環(huán)、改善老年人健忘癥等功能。

近幾年，隨著年輕人飲酒習(xí)慣的改變，對(duì)于酒的口感要求開始朝清新柔和的方向轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致果酒需求量逐年上升。據(jù)調(diào)查顯示，2011年～2016年我國果酒銷售年增長率平均達(dá)23%[19]。如今，新型果酒產(chǎn)品研發(fā)具有廣闊的市場(chǎng)前景。本試驗(yàn)以青海地區(qū)狹果茶藨子果實(shí)為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化狹果茶藨子果酒發(fā)酵工藝，制備得到新型狹果茶藨子果酒，以期豐富現(xiàn)有果酒品種，并為狹果茶藨子在果酒上的應(yīng)用提供參考，進(jìn)而促進(jìn)青藏高原茶藨子資源的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

狹果茶藨子：采自青海省互助縣；果膠酶（酶活力≥60 000 U/mL）、香檳酵母、降酸酵母、陳釀型干紅酵母、焦亞硫酸鉀、發(fā)酵助劑：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；丹寶利釀酒高活性干酵母：丹寶利酵母股份有限公司；安琪果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；單寧：齊齊哈爾臺(tái)龍食品有限公司；白砂糖：山東雅匯糖業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YM-75高壓蒸汽滅菌鍋：海三申醫(yī)療器械有限公司；JA1003電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；DHG 9070A電子鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WDP-450電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)：蘇州島津儀器有限公司；PAL-109酒精計(jì)：河北省武強(qiáng)縣威爾儀表廠。

1.3 狹果茶藨子果酒制備工藝

1.3.1 工藝流程

原料處理→打漿→果膠酶酶解→調(diào)酸→調(diào)糖→添加SO2、單寧、發(fā)酵助劑→接種酵母→發(fā)酵→過濾→澄清→滅菌裝瓶

1.3.2 操作要點(diǎn)

原料選取及破碎：選取果粒大且飽滿、無蟲眼的狹果茶藨子鮮果，去除果梗后，打漿備用。

果膠酶處理：果膠酶添加量為0.5 g/L，在45℃水浴鍋中酶解4 h，以提高果漿的出汁率。

添加SO2、單寧、發(fā)酵助劑：焦亞硫酸鉀、單寧和發(fā)酵助劑的添加量分別為0.1 g/L、0.1%和0.5%，并與果漿充分混勻。

酵母活化：釀酒酵母用5%的糖水活化20 min，確保酵母的活性，再加入到果漿中攪勻。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先以不同種類酵母（香檳酵母、降酸酵母、陳釀型干紅酵母、丹寶利釀酒高活性干酵母、安琪果酒專用酵母）、主發(fā)酵時(shí)間（5、6、7、8、9、10、11 d）、初始糖含量（10%、15%、20%、25%、30%、35%）、初始 pH 值（2、3、4、5、6、7）、酵母添加量（0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%）為單因素，在發(fā)酵溫度為28℃的條件下按照1.3.1的工藝流程發(fā)酵。再以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇初始糖含量（A）、酵母添加量（B）、主發(fā)酵時(shí)間（C）為評(píng)價(jià)因素設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平設(shè)計(jì)見表1，以果酒酒精度和感官評(píng)分為指標(biāo)，確定果酒發(fā)酵的最佳工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface factor level

1.3.4 理化指標(biāo)檢測(cè)及感官評(píng)價(jià)方法

總糖：參考王文平等[20]的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定狹果茶藨子果酒中的總糖含量。以葡萄糖作為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.654 6X+0.022 7，R2=0.997；總酸：參考蔡成翔[21]的方法，利用酸堿滴定原理測(cè)定；總揮發(fā)酸：參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]檢測(cè)狹果茶藨子果酒中總揮發(fā)酸含量；總有機(jī)酸：參考曾竟藍(lán)等[23]的方法，以沒食子酸作為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.211 8X+0.123 2，R2=0.998，計(jì)算總有機(jī)酸含量；總酚：參考吳彭等[24]的方法，采用福林酚法測(cè)定狹果茶藨子果酒中的總酚含量；還原糖：參考李雪梅等[25]的方法，采用直接滴定法測(cè)定狹果茶藨子果酒中的還原糖含量；總黃酮：參考張自萍等[26]的方法，以蘆丁作為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=22.6X+0.036 8，R2=0.997，計(jì)算總黃酮含量；微生物檢測(cè)：菌落總數(shù)的檢測(cè)采用平板計(jì)數(shù)法[27]，大腸菌群的檢測(cè)采用乳糖發(fā)酵法，致病菌不得檢出。

感官評(píng)價(jià)方法：主發(fā)酵結(jié)束后，選取15名食品專業(yè)人員從狹果茶藨子果酒的色澤、澄清度、香氣、滋味4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 感官評(píng)價(jià)Table 2 Sensory evaluation

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳活性干酵母篩選

不同酵母菌菌種對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度和感官評(píng)分的影響見表3。

表3 不同酵母菌菌種對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度、感官評(píng)分的影響Table 3 Effect of different yeast strains on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由表3可知，降酸酵母主發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒精度最高，為13.2%vol，感官評(píng)分也最高，為87分，最終發(fā)酵酒體呈橙黃色、澄清透明、協(xié)調(diào)適口，具有獨(dú)特狹果茶藨子果香，其它酵母發(fā)酵得到的果酒整體口感偏酸。這說明在降酸酵母作用下，狹果茶藨子果實(shí)中豐富的有機(jī)酸被利用轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，可以有效改善狹果茶藨子果實(shí)原有的酸澀口感，且降酸酵母相比其他酵母可有效縮短狹果茶藨子果酒主發(fā)酵時(shí)間。

不同酵母菌菌種發(fā)酵過程中總糖含量變化見圖1。

圖1 不同酵母菌對(duì)狹果茶藨子果酒總糖變化的影響Fig.1 The effect of different yeasts on the fermentation of R.stenocarpum fruit wine

由圖1可知，丹寶利酵母發(fā)酵較慢，且從第2天起總糖含量下降較快；香檳酵母和陳釀型干紅酵母發(fā)酵較旺盛，第10天時(shí)主發(fā)酵結(jié)束；安琪果酒專用酵母第7天時(shí)發(fā)酵較劇烈，總糖含量迅速下降，第11天主發(fā)酵結(jié)束；使用降酸酵母進(jìn)行發(fā)酵，從第2天開始，總糖含量呈穩(wěn)定下降趨勢(shì)，由最初249.65 g/L下降至4.36 g/L，主發(fā)酵第8天時(shí)終止，發(fā)酵過程較穩(wěn)定。降酸酵母在果酒發(fā)酵過程中發(fā)酵平穩(wěn)，發(fā)酵時(shí)間適中，酒體風(fēng)味和口感最好，綜合酒精度和感官評(píng)分的結(jié)果，選擇降酸酵母作為狹果茶藨子果酒制備的主要酵母。

2.2 主發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

主發(fā)酵時(shí)間對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見圖2。

圖2 主發(fā)酵時(shí)間對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.2 The effect of main fermentation time on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖2可知，狹果茶藨子果酒酒體的酒精度和感官評(píng)分隨著主發(fā)酵時(shí)間延長呈現(xiàn)先增大再下降的趨勢(shì)。發(fā)酵至第8天時(shí)，果酒的酒精度和感官評(píng)分均達(dá)最高，酒精度為13.5%vol，感官評(píng)分為89分。結(jié)合2.1結(jié)果可知，主發(fā)酵時(shí)間較短時(shí)發(fā)酵不充分，酒體中總糖含量高，酒精度和香氣成分積累不夠，進(jìn)而會(huì)影響酒體的感官品質(zhì)；當(dāng)主發(fā)酵時(shí)間過長時(shí)由于營養(yǎng)物質(zhì)的過度消耗不利于酵母菌生長繁殖，此時(shí)酵母菌會(huì)大量自溶或者代謝產(chǎn)生不良產(chǎn)物。因此，選擇8 d為果酒發(fā)酵的最佳主發(fā)酵時(shí)間。

2.3 初始糖含量單因素試驗(yàn)結(jié)果

初始糖含量對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見圖3。

圖3 初始糖含量對(duì)狹果狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.3 The effect of initial sugar content on the alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖3可知，初始糖含量為10%、15%時(shí)，果酒的口感有酸澀味，且酒精度和感官評(píng)分偏低；初始糖含量為30%時(shí)果酒酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，酒精度達(dá)14.5%vol，感官評(píng)分為88分。初始糖含量為35%時(shí)，果酒的口感偏甜，掩蓋了狹果茶藨子果實(shí)本身獨(dú)有的風(fēng)味。因此，選擇初始糖含量30%作為茶藨子果酒發(fā)酵的最佳初始糖含量。

2.4 初始pH值單因素試驗(yàn)結(jié)果

初始pH值對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見圖4。

圖4 初始pH值對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.4 The effect of initial pH on the alcohol content and sensory scores of R.stenocarpum fruit wine

由圖4可知，當(dāng)初始pH值為2、3、4時(shí)，果酒的口感較酸，當(dāng)初始pH值調(diào)整至5時(shí)，果酒的口感風(fēng)味較好，酒精度和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，酒精度達(dá)14.0%vol，感官評(píng)分為87分，pH值進(jìn)一步增加，果酒略帶鈉鹽味，感官評(píng)分較低。因此，初始pH 5適宜茶藨子果酒發(fā)酵。

2.5 酵母添加量單因素試驗(yàn)結(jié)果

酵母添加量對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響見圖5。

圖5 酵母添加量對(duì)狹果茶藨子果酒酒精度及感官評(píng)分的影響Fig.5 The effect of yeast addition on alcohol content and sensory score of R.stenocarpum fruit wine

由圖5可知，酵母添加量為0.02%和0.03%時(shí)，果酒酒精度和感官評(píng)分都較低，可見此時(shí)發(fā)酵并不完全；酵母添加量為0.05%時(shí)酒精度和感官評(píng)分均達(dá)最大值，酒精度為14.2%vol，感官評(píng)分達(dá)88分，此時(shí)果酒的香氣成分和風(fēng)味物質(zhì)形成較完全；繼續(xù)增加酵母添加量，酒精度和感官評(píng)分均下降，這可能是酵母對(duì)發(fā)酵底物消耗速度過快造成的。因此，選擇酵母添加量0.05%作為果酒發(fā)酵的最佳條件。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

狹果茶藨子果酒發(fā)酵的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Response surface test results and analysis

表5 以感官評(píng)分為指標(biāo)的響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 The variance analysis result of response surface test with sensory score as index

采用多元回歸擬合上述試驗(yàn)結(jié)果，得到以感官評(píng)分為目標(biāo)函數(shù)Y=-1 016.8+20.29A-0.12B+121.6C-70AB+0.2AC-300BC-0.284A2-71B2-7.1C2。由表5可知，該試驗(yàn)?zāi)Ｐ?P＜0.01（極顯著），失擬項(xiàng) P=0.995 0（不顯著），此外，該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.974 7，說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮O(shè)計(jì)合理，能充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，可用于狹果茶藨子果酒制備的工藝分析和預(yù)測(cè)。在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)狹果茶藨子感官評(píng)分的影響依次為A>B>C，即初始糖含量＞酵母添加量＞主發(fā)酵時(shí)間。

2.6.2 交互作用分析

各個(gè)因素交互作用關(guān)系見圖6。

圖6 兩因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot of the interaction of each two factors

由圖6可知，A與B、B與C交互作用的三維圖較陡，曲面變化較為明顯，等高線圖呈橢圓形，說明A、B交互作用和B、C交互作用對(duì)果酒的感官評(píng)分影響較大，初始糖含量的曲線變化幅度較大，尤其說明該因素對(duì)果酒感官評(píng)分的影響較大；A與C交互作用三維圖坡面較陡，但變化不顯著，故主發(fā)酵時(shí)間與初始糖含量的交互作用對(duì)茶藨子果酒的感官評(píng)分影響并不明顯。

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析，狹果茶藨子果酒最佳發(fā)酵工藝條件為：初始糖含量30.13%，酵母添加量0.047%，主發(fā)酵時(shí)間8 d，在此條件下，得到果酒酒精度為14.10%vol，感官評(píng)分為95分。考慮到實(shí)際可操作性和便利性，將主發(fā)酵條件修正為初始糖含量30%，酵母添加量為0.05%，主發(fā)酵時(shí)間為8 d，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)過3組平行試驗(yàn)，得到最終狹果茶藨子果酒酒精度為14.0%vol，感官評(píng)分為94分，與模型預(yù)測(cè)值接近，驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

2.7 狹果茶藨子果酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

狹果茶藨子果酒理化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 狹果茶藨子果酒理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination of physical and chemical indexes of Ribes stenocarpum wine

由表6可知，發(fā)酵得到的狹果茶藨子果酒中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，其中總酚含量達(dá)1.36 g/L，總黃酮含量達(dá)2.15 g/L，這可能是其風(fēng)味的主要物質(zhì)來源，具體風(fēng)味成分種類有待進(jìn)一步分離鑒別。狹果茶藨子果酒細(xì)菌總數(shù)為16 CFU/mL（≤100 CFU/mL），未檢測(cè)出大腸桿菌和致病菌，符合相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面分析法得到狹果茶藨子果酒的最佳發(fā)酵工藝條件：初始糖含量30%，初始pH5，酵母添加量0.05%，主發(fā)酵時(shí)間8 d。在此工藝條件下發(fā)酵得到的果酒色澤鮮艷，呈橙黃色，果香濃郁，滋味醇厚，酒體協(xié)調(diào)，酒精度達(dá)14.0%vol，感官評(píng)分94分。測(cè)得果酒中總酸含量30.35 g/L，揮發(fā)酸含量為0.32 g/L，總有機(jī)酸含量為1.16 g/L，總糖含量4.36 g/L，還原糖含量4.27 g/L，總酚含量1.36 g/L，總黃酮含量2.15 g/L，細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌總數(shù)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。