雷帕霉素介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶信號通路對肝癌細(xì)胞的影響

鞏 江 賀 學(xué) 沙 莎 戎 浩 倪士峰

（1 西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，咸陽 712082；2 西北大學(xué)生科院中藥系，西安 710000）

隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷進(jìn)步，靶向治療逐漸應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床研究中，雷帕霉素（rapamycin，RAPA）屬于大黃內(nèi)酯類藥物，易溶于脂肪，能夠抑制mTOR信號通路活性，多應(yīng)用于臟器移植及心腦血管疾病的治療[1]。目前，大量研究表明，雷帕霉素在胃癌及肺癌臨床中具有抗腫瘤作用。絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路主要包含3種：JNK（正c-Jun氨基末端轉(zhuǎn)移酶）、P38、細(xì)胞外信號調(diào)控激酶（ERK）通路，參與多種惡性腫瘤進(jìn)程。研究表明，細(xì)胞因子及細(xì)胞外的刺激因子均可調(diào)節(jié)MAPK信號通路表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移參與血腦屏障的損傷作用[2-3]。凋亡蛋白家族中，Bax可促進(jìn)凋亡，Bcl-2、Bcl-xl作用與之相反，均參與癌細(xì)胞的凋亡及增殖[4]。本研究探討雷帕霉素介導(dǎo)MAPK信號通路對肝癌細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、儀器與試劑

人肝癌細(xì)胞BEL-7402細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；雷帕霉素（Fermanter公司，Israel）；Bcl-2、Bcl-xl及Bax抗體（Santa Cruz公司，USA）；MAPK抗體（Abcam；USA）；流式細(xì)胞儀（常州必達(dá)科生物）。

1.2 試劑配制

MTT溶液：將MTT粉末溶于PBS緩沖液中制成5 ng/mL的溶液，低溫保存。雷帕霉素：將1 mg/mL的雷帕霉素溶于DMSO中，濃度為1 000 mg/mL，低溫保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將低溫冷藏的BEL-7402 細(xì)胞，快速移入37℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，5%CO2，37.5℃保存，貼壁生長，次日更換培養(yǎng)基，生長到90%時，進(jìn)行1∶3 傳代，繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)生長細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4 顯微鏡下觀察BEL-7402 細(xì)胞形態(tài)

取對數(shù)生長細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103接種至96 孔板中，培養(yǎng)24 h，對照組不加入雷帕霉素干預(yù)（對照組），RAPA 處理組加入濃度20 ng/mL（20 ng/mL RAPA 組）、50 ng/mL（50 ng/mL RAPA組）、100 ng/mL（100 ng/mL RAPA 組）雷帕霉素，24 h 后，于顯微鏡下觀察形態(tài)并拍照。

1.5 MTT 法檢測BEL-7402 細(xì)胞增殖

將濃度為1 000 ng/mL 的雷帕霉素溶液采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 的FBS 分別調(diào)整濃度為（10、20、50、100）ng/mL，取數(shù)目為5×103/mL 接種到96 孔板中，肝癌細(xì)胞對照組未加入藥物，RAPA 處理組加入以上多個濃度雷帕霉素，培養(yǎng)12、24、48、60 h 及72 h，結(jié)束后，在每個孔內(nèi)加入20 μL MTT，4 h 后，加入150 μL DMSO，搖勻15 min，采用酶標(biāo)儀于570 nm 波長檢測每個孔人BEL-7402 細(xì)胞增殖。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測

將BEL-7402 細(xì)胞以5×103/mL 數(shù)量置于96 孔板，培養(yǎng)1 d 后，在BEL-7402 細(xì)胞內(nèi)加入少量胰蛋白酶，消化4 h 后，用冷藏在-20℃的醫(yī)用乙醇固定，24 h 后進(jìn)行離心，棄去上清液，PBS 反復(fù)洗滌3 次，每次3～5 min，避光染色，后采用流式細(xì)胞儀分析BEL-7402 細(xì)胞凋亡程度。

1.7 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測組織MAPK 陽性表達(dá)

對對照組和RAPA 處理組BEL-7402 細(xì)胞進(jìn)行爬片處理，加入2 ng/mL 多聚甲醛，固定，采用免疫細(xì)胞化學(xué)顯色法檢測各組MAPK 陽性表達(dá)。

1.8 免疫印跡檢測Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白表達(dá)

收集對照組及RAPA 處理組BEL-7402 細(xì)胞，在96 孔板中加入100 μg 的胰蛋白酶提取液，將細(xì)胞提取液放入EP 管中，并與胰蛋白酶提取液按照1∶100 進(jìn)行混合，再放入冰箱中冷凍10 min。使細(xì)胞完全裂變，成為E 溶液；在EP 管中放入BEL-7402 細(xì)胞，并按照1∶100 比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使細(xì)胞完全裂變，成為F 溶液；再把E和F 溶液以80∶1 的體積進(jìn)行搖勻，配制成工作液，放入37.5℃的保溫箱中20 min，冷卻后計算Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白的濃度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS22.0 軟件進(jìn)行分析BEL-7402 細(xì)胞增殖、凋亡，MAPK 陽性表達(dá)，Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白相關(guān)性，數(shù)據(jù)用±s表示，行χ2或t檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAPA 對BEL-7402 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

倒置顯微鏡觀察，對照組細(xì)胞呈梭形生長，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核正常。RAPA 處理組BEL-7402 細(xì)胞生長明顯受到抑制，20 ng/mL RAPA 組BEL-7402細(xì)胞壁逐漸脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，50 ng/mL RAPA 組 BEL-7402 細(xì)胞呈現(xiàn)透明度及黏附力逐漸降低，形態(tài)呈現(xiàn)不規(guī)則改變，細(xì)胞數(shù)目減少，100 ng/mL RAPA 組BEL-7402 細(xì)胞形成分裂小體，固縮凋亡（圖1）。

圖1 RAPA 對BEL-7402 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響，×200

2.2 雷帕霉素對BEL-7402 細(xì)胞增殖抑制率的影響

對照組BEL-7402 細(xì)胞增殖抑制率最低，RAPA 處理組BEL-7402 細(xì)胞增殖抑制率高于對照組（P<0.05）；隨著時間延長及雷帕霉素濃度的升高，細(xì)胞生長抑制率逐漸升高，RAPA 干預(yù)處理100 ng/mL RAPA 組在24、48 h 及72 h 的BEL-7402細(xì)胞生長抑制率高于20 ng/mL、50 ng/mL RAPA組（P<0.05）（圖2）。

圖2 雷帕霉素對BEL-7402 細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.3 雷帕霉素對BEL-7402 細(xì)胞凋亡率的影響

對照組細(xì)胞的凋亡率為7.17%，20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL RAPA 組細(xì)胞的凋亡率分別為18.89%、25.77%、38.56%。RAPA 處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），100 ng/mL RAPA 組凋亡率高于20 ng/mL 、50 ng/mL RAPA 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明隨著濃度的升高，BEL-7402 細(xì)胞凋亡率升高（圖3）。

圖3 雷帕霉素對BEL-7402 細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 RAPA 對BEL-7402 細(xì)胞中MAPK 陽性表達(dá)率的影響

對照組BEL-7402 細(xì)胞中MAPK 陽性表達(dá)率高于RAPA 處理組（P<0.05），隨著雷帕霉素濃度的升高，RAPA 處理組MAPK 陽性表達(dá)率不斷降低，100 ng/mL RAPA 組中MAPK 陽性表達(dá)率低 于 組50 ng/mL RAPA 組（P<0.05），50 ng/mL RAPA 組MAPK 陽性表達(dá)率低于20 ng/mL RAPA 組（P<0.05）（圖4）。

圖4 BEL-7402 細(xì)胞MAPK 陽性表達(dá)率

2.5 雷帕霉素對BEL-7402 細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影響

對照組BEL-7402 細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-xl 蛋白升高，與RAPA 處理組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），RAPA 處理組Bcl-2、Bcl-xl 蛋白水平隨著雷帕霉素的濃度升高而降低，兩兩比較存在差異（P<0.05），20 ng/mL RAPA 組 BEL-7402 細(xì)胞中Bcl-2、Bcl-xl水平高于50 ng/mL RAPA組（P<0.05），50 ng/mL RAPA 組 Bcl-2、Bcl-xl 表達(dá)水平高于100 ng/mL RAPA 組（P<0.05），Bax 水平與Bcl-2、Bcl-xl 相反（圖5，表2）。

表2 RAPA 對各組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影響（n=5，±s）

表2 RAPA 對各組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 蛋白水平的影響（n=5，±s）

*P<0.05 vs 對照組；△P<0.05 vs 20 ng/mL RAPA 組；#P<0.05 vs 50ng/mL RAPA 組

組別BaxBCL-2Bcl-xl對照組0.014±0.0020.026±0.0040.031±0.005 20 ng/mL RAPA 組0.021±0.003*0.022±0.002*0.026±0.003*50 ng/mL RAPA 組0.024±0.005*△0.021±0.001*△0.023±0.002*△100 ng/mL RAPA 組0.029±0.006*△#0.015±0.001*△#0.017±0.001*△#

圖5 各組細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl 及Bax 表達(dá)水平

3 討論

雷帕霉素最初被作為抗真菌藥物，后逐漸應(yīng)用于器官移植實驗中，雷帕霉素對肺癌、腎癌等具有抗癌細(xì)胞擴散及增殖作用[5]。動物實驗表明，RAPA 輔助用藥或聯(lián)合其他藥物能夠減少癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，主要是通過抑制血管生長因子的分化來遏制腫瘤細(xì)胞的生成和發(fā)展，對治療惡性腫瘤患者的器官移植具有重要作用[6-7]。

肝癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展是一個復(fù)雜且多環(huán)節(jié)的過程，臨床中對肝癌細(xì)胞的遏制方法主要包含減少肝癌細(xì)胞活性、抑制其增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究中，雷帕霉素處理組的BEL-7402細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率隨著雷帕霉素濃度升高和時間增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸改變，癌細(xì)胞崩解壞死。雷帕霉素對肝癌細(xì)胞的抑制機制主要通過兩個方面，一種是對肝癌細(xì)胞mTOR進(jìn)行滅活，mTOR對肝癌細(xì)胞具有調(diào)節(jié)生物學(xué)行為的作用，并通過其他因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)處侵襲[9-10]。雷帕霉素具有抗腫瘤突變作用，對mTOR磷酸化的肝癌細(xì)胞藥物敏感性較強，減少mTOR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，遏制肝癌細(xì)胞增殖，加快凋亡。另一種是減少肝癌細(xì)胞中血管生長因子表達(dá)，并已經(jīng)成為研究的熱點[11-12]。錢妍至等[13]研究表明，雷帕霉素對肝癌細(xì)胞具有抑制作用，具有時間劑量性，能夠加快癌細(xì)胞進(jìn)入凋亡期，提高細(xì)胞凋亡率，這與趙嵌嵌等[14]研究結(jié)果相似。

MAPK家族具有連接肝癌細(xì)胞受體與DNA表達(dá)之間信號調(diào)節(jié)的作用，具有促進(jìn)分化及生長存活作用。其下經(jīng)典的通路包含多種，在肝癌細(xì)胞中MAPK與mTOR能夠相互作用，共同促進(jìn)肝癌細(xì)胞激活[15]。雷帕霉素屬于mTOR抑制劑，會減少MAPK與mTOR之間的激活，減少其表達(dá)。本研究中，雷帕霉素處理組BEL-7402細(xì)胞中的MAPK陽性表達(dá)率低于對照組，并隨著雷帕霉素濃度的升高而減少。與毛良浩等[16]報道雷帕霉素能夠抑制MAPK磷酸化，并具有較強的濃度依賴性的研究結(jié)果相似。

Bcl-2家族在多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮作用，下游因子分為不同亞型，Bcl-2、Bcl-xl能夠減少肝癌細(xì)胞壞死，Bax作用與之相反，具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞壞死作用，減少肝癌腫瘤壞死，延長存活期[17-18]。本研究結(jié)果顯示，雷帕霉素能夠抑制Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)，提高Bax水平，這與雷帕霉素能夠加快線粒體體膜電位丟失，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，雷帕霉素能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，加快壞死及破裂，隨著雷帕霉素濃度升高，凋亡程度增大，其作用機制可能與抑制MAPK、Bcl-2、Bcl-xl 表達(dá)，促進(jìn)Bax 水平升高有關(guān)。