橙皮素與鐵蛋白的共價(jià)相互作用及其對(duì)鐵蛋白理化性質(zhì)的影響

陳盛楠，劉玉茜，劉夢(mèng)肴，孫冀萱，楊 瑞*

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

鐵蛋白是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的鐵存儲(chǔ)蛋白[1]，是由24 個(gè)亞基對(duì)稱組成的一個(gè)球狀分子。其內(nèi)徑為8 nm，外徑為12 nm[2]。鐵蛋白亞基圍繞形成12 個(gè)二重軸通道、8 個(gè)三重軸通道和6 個(gè)四重軸通道[3]，這些通道被認(rèn)為是小分子物質(zhì)進(jìn)出鐵蛋白的媒介[4]。鐵蛋白能夠在其內(nèi)部空腔存儲(chǔ)可溶的、無(wú)毒的、生物可利用的Fe3+并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鐵代謝平衡，是開發(fā)補(bǔ)鐵制劑的良好原料[1]。因此鐵蛋白在食品、藥品、保健品方面具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，鐵蛋白在食品加工環(huán)境中（例如熱、氧、pH值）不夠穩(wěn)定進(jìn)而破壞其結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的應(yīng)用。

利用食品天然組分（如多酚類物質(zhì)）構(gòu)建蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物是提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的良好途徑。蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)合包括共價(jià)[5]和非共價(jià)[6]2 種結(jié)合方式。非共價(jià)相互作用主要是指蛋白質(zhì)和多酚以氫鍵、范德華力、疏水作用等方式結(jié)合[7-9]。蛋白質(zhì)和多酚共價(jià)結(jié)合的方式主要包括酶促反應(yīng)[10]和非酶促反應(yīng)[11-12]。通常，共價(jià)相互作用相對(duì)于非共價(jià)相互作用表現(xiàn)出更強(qiáng)的作用力[13]。非酶促反應(yīng)的共價(jià)相互作用一般發(fā)生在氧氣存在條件下的堿性溶液中，多酚被氧化成醌后，可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的氨基酸殘基（色氨酸、賴氨酸、半胱氨酸）生成穩(wěn)定的化學(xué)鍵進(jìn)而形成蛋白質(zhì)-多酚共價(jià)復(fù)合物[14-15]。目前，麥醇溶蛋白、南瓜種子蛋白分離物已被報(bào)道可與多酚進(jìn)行共價(jià)結(jié)合進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[16-17]。橙皮素（5,7,30-三羥基-40-甲氧基黃烷酮）是在柑橘類水果中常見的一種天然黃酮化合物。橙皮素是橙皮苷的糖基配體，其結(jié)構(gòu)中含有酮羰基、醚基、甲氧基以及多個(gè)酚羥基，使其具有較為廣泛的藥理作用，例如抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力等[18]，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域。

本研究以鐵蛋白和橙皮素為材料，通過(guò)堿處理制備鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物。采用熒光光譜研究不同濃度橙皮素與鐵蛋白的結(jié)合程度，并揭示復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化；采用溶解度、Zeta電位、熱重、氧化沉淀和還原釋放等指標(biāo)考察橙皮素對(duì)鐵蛋白理化性質(zhì)的影響。這項(xiàng)研究將有助于改善鐵蛋白的理化性質(zhì)，并且可在功能食品和制藥工業(yè)中拓展新的應(yīng)用方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橙皮素 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙醇（分析純）天津市江天化工技術(shù)有限公司；過(guò)硫氨酸、甘氨酸、福林-酚 北京索萊寶生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇和考馬斯亮藍(lán)R250 中國(guó)國(guó)藥控股有限公司；電泳標(biāo)記 美國(guó)GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；FG2 pH計(jì) 美國(guó)Mettler-Toledo公司；ZWJ-2102C恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；VE180電泳槽 天能電池集團(tuán)股份有限公司；Zetaizer Nano ZS90激光粒度儀 英國(guó)馬爾文公司；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)、8453紫外分光光度計(jì) 美國(guó)安捷倫公司；UV 3600 Plus紫外-可見近紅外分光光度計(jì) 日本島津公司；TGA-Q50型熱重分析儀 美國(guó)TA公司。

1.3 方法

1.3.1 鐵蛋白的提取與純化

根據(jù)已報(bào)道的方法[19]，制備由大腸桿菌BL21菌株表達(dá)的重組大豆種子H-2亞基鐵蛋白（recombinant soybean seed H-2 subunit ferritin，rH-2），其與大豆種子鐵蛋白的H-2型亞基具有相似的氨基酸分布，制備的鐵蛋白內(nèi)部空腔不含有鐵離子，是缺鐵的鐵蛋白。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

通過(guò)SDS-PAGE檢驗(yàn)分離純化后的鐵蛋白純度和分子質(zhì)量。電泳在15 mA恒流條件下進(jìn)行，完成后使用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色。

1.3.3 鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的制備

按照已報(bào)道的方法制備橙皮素共價(jià)修飾的鐵蛋白[20]。將橙皮素（0.03 g）溶于體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液（10 mL）中，并磁力攪拌25 min以制備儲(chǔ)備溶液。用NaOH（0.1 mol/L）溶液將鐵蛋白溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.0。將橙皮素溶液稀釋并與4 組鐵蛋白樣品混合，使物質(zhì)的量比為40∶1、80∶1、120∶1或160∶1（橙皮素/鐵蛋白）。上述4 種溶液中乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)分別為0.14%、0.28%、0.42%和0.56%。這些低體積分?jǐn)?shù)的乙醇不會(huì)破壞鐵蛋白的穩(wěn)定性。將這些混合物的pH值重新調(diào)節(jié)至9.0，然后用攪拌器在25 ℃充分混合24 h（暴露于空氣中）。將疊氮化鈉（0.2 g/L）添加到混合物中以防止微生物生長(zhǎng)。最后將混合物用去離子水（pH 7.0）透析（截留分子質(zhì)量為10 kDa）48 h，變化間隔為6 h，以確保未反應(yīng)的游離橙皮素被完全透析出去。收集液體并命名為鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物。由于鐵蛋白空腔中無(wú)鐵離子，在鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的形成及貯存過(guò)程中是沒有鐵離子參與的，避免了鐵離子的氧化作用對(duì)復(fù)合物的破壞。

1.3.4 熒光光譜分析

使用熒光分光光度計(jì)對(duì)鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物（0.25 μmol/L，1.5 mL）進(jìn)行熒光光譜分析。激發(fā)縫和發(fā)射縫分別為5 nm和10 nm。激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，并且在300～500 nm的范圍內(nèi)收集掃描發(fā)射光譜。

1.3.5 溶解性分析

利用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物（0.5 μmol/L）的pH值（2～11），然后4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液采用考馬斯亮藍(lán)法[21]測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素復(fù)合物的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比[22]。

1.3.6 Zeta電位分析

使用激光粒度儀分析樣品的Zeta電位。將鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物、鐵蛋白（0.5 μmol/L）分別調(diào)節(jié)至不同pH值（4.0、5.0、5.5、6.0和7.0），在25 ℃條件下通過(guò)Zeta電位分析儀運(yùn)行6 次。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。

1.3.7 鐵蛋白的鐵氧化沉積分析

通過(guò)向缺鐵鐵蛋白體系（0.5 μmol/L）添加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最終Fe2+濃度為48 μmol/L，根據(jù)報(bào)道的方法分析鐵的氧化沉積性質(zhì)[23]。使用紫外-可見近紅外分光光度計(jì)，通過(guò)記錄25 ℃條件下波長(zhǎng)300 nm的吸光度進(jìn)行測(cè)量。在90 s內(nèi)記錄鐵的氧化動(dòng)力學(xué)，根據(jù)報(bào)道的方法測(cè)量鐵的初始氧化速率[23]。

1.3.8 鐵蛋白的鐵還原釋放分析

通過(guò)向鐵蛋白樣品溶液（0.5 μmol/L，pH 7.0）中以20 min間隔逐漸加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最終Fe2+濃度為300 μmol/L，制備載鐵鐵蛋白。載鐵鐵蛋白釋放鐵的方法如下：每個(gè)反應(yīng)體系（1 mL）包含0.5 μmol/L鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物，500 μmol/L菲洛嗪（ferrozine）。通過(guò)加入抗壞血酸（1 mmol/L）引發(fā)鐵還原釋放反應(yīng)。通過(guò)記錄波長(zhǎng)562 nm處吸光度的增加測(cè)量[Fe(ferrozine)3]2+的形成，并按摩爾吸光系數(shù)ε562為27.9 L/（mmol?cm）測(cè)量鐵的釋放[24]，并計(jì)算鐵釋放的初始速率（v0）。

1.3.9 熱重分析

使用熱重分析技術(shù)對(duì)鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行熱分析。將凍干的粉末狀樣品（3.5 mg）放入鋁鍋中稱質(zhì)量，然后放入熱重分析儀中?？珍X鍋為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，氮?dú)庖?0 ℃/min的升溫速率在50～600 ℃的溫度下，對(duì)不同樣品進(jìn)行熱重測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵蛋白的制備

本研究使用重組大豆rH-2鐵蛋白作為鐵蛋白原料，它與天然H-2型大豆種子鐵蛋白的氨基酸序列高度相似，且更易于獲取[19]。將純化后的鐵蛋白通過(guò)SDS-PAGE確定其亞基分子質(zhì)量，SDS-PAGE結(jié)果顯示它由一個(gè)分子質(zhì)量28.0 kDa的亞基組成（圖1），與文獻(xiàn)[25]報(bào)道一致。因此，純化后的鐵蛋白符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 鐵蛋白純化后的電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profile of purified ferritin

2.2 鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的熒光分析

每個(gè)鐵蛋白亞基的E螺旋上都有1 個(gè)色氨酸殘基[3]，可用于分析鐵蛋白的熒光變化。與對(duì)照鐵蛋白相比，熒光光譜中所有共價(jià)復(fù)合物的強(qiáng)度均顯著降低（圖2），這表明橙皮素的結(jié)合影響鐵蛋白的結(jié)構(gòu)。隨著橙皮素含量的增加（物質(zhì)的量比40∶1～160∶1），形成的共價(jià)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度逐漸降低。隨著反應(yīng)體系中橙皮素含量增加（物質(zhì)的量比80∶1～160∶1），響應(yīng)值的變化并不顯著。因此橙皮素與鐵蛋白的反應(yīng)在80∶1比例可能達(dá)到飽和。另外，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物（物質(zhì)的量比40∶1）的熒光光譜相對(duì)對(duì)照鐵蛋白紅移了約6 nm，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物（物質(zhì)的量比80∶1～160∶1）的發(fā)射光譜相對(duì)于對(duì)照鐵蛋白紅移了約10 nm。該現(xiàn)象表明共價(jià)結(jié)合可能導(dǎo)致更多的鐵蛋白側(cè)鏈暴露于溶液中[26]，這會(huì)使色氨酸移至更親水的環(huán)境，因此通過(guò)橙皮素的共價(jià)修飾，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。本研究選用80∶1比例（橙皮素/鐵蛋白）的鐵蛋白-橙皮素復(fù)合產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的熒光光譜分析Fig.2 Fluorescence spectra of ferritin and its complexes with hesperetin at different molar ratios

2.3 溶解度分析

如圖3所示，在pH 2～6范圍內(nèi)，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物與對(duì)照鐵蛋白相比會(huì)有相對(duì)較低的水溶性（P＜0.05），在pH 7～11范圍內(nèi)，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的溶解度提高并且與對(duì)照蛋白相比差異不顯著（P＞0.05）。該發(fā)現(xiàn)與Rawel等[27]報(bào)道類似，其發(fā)現(xiàn)乳清蛋白和槲皮素共價(jià)結(jié)合后，復(fù)合物的溶解度降低。不同的是，Wei Zihao等[13]提出乳蛋白和-表沒食子兒茶素沒食子酸酯共價(jià)結(jié)合會(huì)提高乳蛋白的水溶性。因此，推斷小分子化合物的溶解性可能影響其結(jié)合后形成的復(fù)合物的溶解性。本研究中，疏水性橙皮素的結(jié)合在不同pH值范圍內(nèi)表現(xiàn)出不同的作用，在pH 7～11范圍內(nèi)，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的溶解度表現(xiàn)與對(duì)照蛋白類似。因植物鐵蛋白本身溶解性良好，復(fù)合物溶解度的維持可為其在水性食品形式（如飲料）中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

圖3 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的溶解度Fig.3 Solubility of ferritin and hesperetin-ferritin complex at a molar ratio of 80:1

2.4 Zeta電位分析

如圖4所示，鐵蛋白溶液的Zeta電位在低pH值時(shí)（＜5.25）表現(xiàn)為帶正電荷，高pH值時(shí)（＞5.25）表現(xiàn)為帶負(fù)電荷，零電荷點(diǎn)出現(xiàn)在pH 5.25左右。不同的是，橙皮素共價(jià)結(jié)合后鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的Zeta電位變化明顯。零電荷點(diǎn)出現(xiàn)在pH 4.8左右。此結(jié)果證明了橙皮素的結(jié)合可以顯著降低鐵蛋白的等電點(diǎn)。復(fù)合物等電點(diǎn)的降低有利于擴(kuò)展其在酸性食品和飲料中的應(yīng)用。

圖4 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的Zeta電位Fig.4 Zeta potentials of ferritin and hesperetin-ferritin complex

2.5 鐵的氧化沉淀分析

鐵蛋白的氧化沉淀活性是指鐵蛋白利用其氧化位點(diǎn)可將Fe2+在氧存在條件下氧化成Fe3+的過(guò)程，生成的Fe3+可以被運(yùn)輸并貯藏于鐵蛋白的空腔結(jié)構(gòu)中。本研究利用波長(zhǎng)300 nm處的紫外吸收監(jiān)測(cè)鐵蛋白鐵氧化沉淀過(guò)程中Fe3+的形成[28]。實(shí)驗(yàn)選用96 Fe2+/鐵蛋白體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照鐵蛋白最初以22.50 μmol/s的速率催化Fe2+的氧化（圖5）。不同的是，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的Fe2+氧化初始速率為32.36 μmol/s，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。因此，橙皮素在鐵蛋白上的結(jié)合促進(jìn)了鐵蛋白的鐵氧化沉淀活性。鐵蛋白的鐵氧化位點(diǎn)通常位于其親水性3 倍軸通道上，該通道被認(rèn)為是鐵離子通過(guò)蛋白質(zhì)外殼進(jìn)入內(nèi)部的途徑[29]，橙皮素的結(jié)合可能影響了鐵蛋白3 倍軸通道的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而一定程度上促進(jìn)了鐵離子的氧化。在鐵離子的代謝過(guò)程中，機(jī)體過(guò)量的Fe2+水平會(huì)產(chǎn)生毒副作用，表現(xiàn)為其能夠誘發(fā)產(chǎn)生很強(qiáng)氧化能力的羥自由基，易造成細(xì)胞損傷甚至死亡。橙皮素對(duì)鐵蛋白的共價(jià)修飾作用促進(jìn)了鐵離子的氧化，該作用可能會(huì)對(duì)減輕鐵離子的毒副作用具有重要意義。

圖5 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物進(jìn)行Fe2＋氧化的時(shí)間過(guò)程Fig.5 Time course of ferrous iron oxidation with ferritin or hesperetinferritin complex

2.6 鐵的還原釋放分析

鐵蛋白的還原釋放是指鐵蛋白在還原劑存在的情況下，將貯藏于鐵蛋白內(nèi)部空腔內(nèi)的Fe3+還原為Fe2+，隨后將Fe2+釋放于外部環(huán)境當(dāng)中。實(shí)驗(yàn)選用600 Fe2+/鐵蛋白體系，鐵蛋白釋放出來(lái)的Fe2+與螯合劑ferrozine可以形成螯合物[Fe(ferrozine)3]2+，該螯合物在波長(zhǎng)562 nm條件下有很強(qiáng)的吸光度，因此可以用于檢測(cè)還原釋放過(guò)程。與氧化沉積途徑不同，植物鐵蛋白的4 倍軸通道通?？勺鳛橹参镨F蛋白鐵釋放的途徑[30]。結(jié)果顯示鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的Fe2+釋放初始速率為4.31 nmol/s，顯著低于鐵蛋白的5.52 nmol/s（P＜0.05）（圖6）。因此，橙皮素的結(jié)合顯著降低了鐵蛋白的鐵還原釋放能力。其可能是由于橙皮素結(jié)合在鐵蛋白外表面引起鐵蛋白結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的。

圖6 1 mmol/L抗壞血酸誘導(dǎo)鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物釋放Fe2＋的動(dòng)力學(xué)Fig.6 Kinetics of Fe2＋ release from ferritin and hesperetin-ferritin complex induced by 1 mmol/L ascorbic acid

2.7 熱重分析

蛋白質(zhì)分解分為3 個(gè)階段，第1階段為水分蒸發(fā)階段，這一階段質(zhì)量損失較少，且漸漸趨于平穩(wěn)；第2階段為質(zhì)量快速分解階段，大部分的蛋白質(zhì)在此階段經(jīng)高溫快速分解，此階段質(zhì)量損失較快；第3階段為質(zhì)量緩慢損失階段[31]。由圖7A可知，對(duì)照鐵蛋白的起始質(zhì)量損失溫度為254 ℃，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的起始質(zhì)量損失溫度為263 ℃，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物較鐵蛋白的起始質(zhì)量損失溫度增加了9 ℃，由此推斷鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的熱穩(wěn)定性具有一定程度的增強(qiáng)[17]。

圖7 鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的熱重（A）和紫外吸收熱變性曲線（B）Fig.7 TGA profiles (A) and UV denaturation curves (B) of ferritin and hesperetin-ferritin complex

為了驗(yàn)證該結(jié)論，比較40～90 ℃范圍內(nèi)鐵蛋白和鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的紫外熱變性曲線（圖7B），研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物的轉(zhuǎn)變溫度為77.8 ℃，顯著高于鐵蛋白的轉(zhuǎn)變溫度（73.2 ℃）（P＜0.05）。推斷鐵蛋白和橙皮素的共價(jià)修飾影響了鐵蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)了鐵蛋白的熱穩(wěn)定性。熱加工通常是食品生產(chǎn)的重要步驟，但是加熱處理可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，鐵蛋白-橙皮素復(fù)合物的形成增強(qiáng)了鐵蛋白的熱穩(wěn)定性，在一定程度上可以提高鐵蛋白在加工過(guò)程中的對(duì)熱耐受性。復(fù)合物的熱穩(wěn)定性的增強(qiáng)也有助于其作為包封食品營(yíng)養(yǎng)小分子的納米載體在涉及熱處理食品中的應(yīng)用。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)堿處理方法制備鐵蛋白-橙皮素共價(jià)復(fù)合物。橙皮素與鐵蛋白相互作用影響了鐵蛋白的結(jié)構(gòu)，并且復(fù)合物在不同pH值條件下的溶解度發(fā)生了一定程度的改變，其等電點(diǎn)明顯降低。另外，橙皮素的結(jié)合提高了鐵蛋白中鐵離子的氧化沉積速率，降低了鐵蛋白中鐵離子的還原釋放速率。同時(shí)，橙皮素的共價(jià)結(jié)合改善了鐵蛋白的穩(wěn)定性。該研究為探索典型食品成分（蛋白質(zhì)和活性組分）的相互作用提供一定理論指導(dǎo)，也為提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性提供一種新途徑。鐵蛋白作為一種納米結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，橙皮素的結(jié)合為其作為活性成分的傳遞載體賦予了新的功能特性，這一發(fā)現(xiàn)將為鐵蛋白在今后食品加工中的應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)和借鑒。