響應面分析法優(yōu)化酶法提取小米谷糠蛋白工藝

曹闊 吳興雨 孫凱楊 姚玥 馬佳 孫豐梅

摘要：采用酶法提取小米谷糠蛋白，對小米谷糠進行脫膠、脫脂處理，以提取率為考察指標，從5種蛋白酶中篩選最適酶制劑。采用單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化酶的添加量、作用時間、作用溫度、浸提pH值，得出對谷糠蛋白提取率的影響。結果表明，小米谷糠蛋白的最佳提取率對應的工藝條件如下：添加0.7%堿性蛋白酶，調節(jié)pH值為9，于50 ℃提取1.8 h，提取率為72.29%。由此可見，用堿性蛋白酶提取谷糠蛋白是一種高效的方法。

關鍵詞：小米谷糠蛋白;蛋白酶;提取率;響應面分析法;酶制劑;單因素試驗

中圖分類號： TS210.4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）18-0169-05

收稿日期：2020-11-12

基金項目：河北省科技廳項目（編號：18227132D）;河北省教育廳項目（編號：ZD2017205）。

作者簡介：曹 闊（1994—），男，碩士研究生，研究方向為糧食副產物的加工與利用。E-mail：879077255@qq.com。

通信作者：孫豐梅，博士，副教授，研究方向為食品副產物加工利用與食品安全檢測。E-mail：shiliu0616@163.com。

谷子（Setaria italica）屬禾本科植物，別稱稷、粟、粱，為一年生草本，目前多種植于歐亞陸地的溫帶和熱帶地區(qū)，我國的黃河中上游是其主要種植區(qū)。谷子在我國的種植歷史可以追溯到六七千年前，是我國重要的糧食作物[1-2]。谷子加工成小米的過程中產生的副產物稱為小米谷糠，小米谷糠富含多種維生素和微量元素，具有益氣健脾、養(yǎng)血安神、補腎健腦的功效，對虧氣血、脾腎功能弱的失眠患者能夠起到積極作用。常食用谷糠能夠提高人體免疫力，小米谷糠不僅可以健身防病，還能治療失眠，是一種理想的補品[3]。在我國，人們更習慣將小米谷糠添加至飼料中。谷子在我國的種植面積廣、產量大，所以產生的小米谷糠也非常多，而小米谷糠中的谷糠蛋白含量豐富[4]。此外，小米谷糠蛋白還有保健及抗癌的作用。許潔研究發(fā)現，小米谷糠清蛋白能對肝功能起到一定的保護作用，且氨基酸含量比大豆蛋白高，有益于嬰兒生長[3]。單樹花通過對小米谷糠蛋白進行分離純化，得到了活性蛋白FMB，并證明其對腫瘤細胞的抑制作用，表明其具有開發(fā)利用的潛力[5-6]。

用酶法提取蛋白質的報道日漸增多，酶法具有條件溫和、操作簡單、得率高等優(yōu)點，能夠更好地保留蛋白質的功能性質。目前，常用的酶類有纖維素酶、蛋白酶、植酸酶、淀粉酶等[7-9]。本試驗通過粉碎、脫脂和超聲等方式對小米谷糠進行前處理，利用Design-Expert 8.0軟件對數據進行響應面分析[10]，進而得出最優(yōu)的提取條件組合，以期為小米谷糠在飼料工業(yè)中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米谷糠，購自河北巡天農業(yè)科技有限公司;酶活性為50 U/mg的酸性蛋白酶;酶活性為100 U/mg的中性蛋白酶;酶活性為200 U/mg的堿性蛋白酶;酶活性為120 U/mg的復合蛋白酶;酶活性為 500 U/mg 的木瓜蛋白酶;牛血清蛋白標準品;考馬斯亮藍G-250、石油醚、無水乙醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設備

79-1磁力加熱攪拌器，購自常州澳華儀器有限公司;JA-1003N電子分析天平，購自上海精密科學儀器有限公司;HH-S數顯恒溫水浴鍋，購自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;JYL-C50T九陽料理機，購自九陽股份有限公司;PHS-3C酸度計，購自上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝 對小米谷糠進行脫脂處理后，粉碎過篩，加入10倍體積的蒸餾水，于超聲中處理 30 min，加入酶，調節(jié)pH值后浸提，于100 ℃滅活酶，離心后收集上清液，測定清蛋白含量;收集離心后的沉淀物并加入0.1 mol/L NaCl，測定球蛋白含量;收集并測定球蛋白沉淀物，加入75%乙醇，測定醇溶性蛋白含量;收集并測定醇溶性蛋白沉淀物，調節(jié)pH值為11，用NaCl溶液溶解，測定谷蛋白含量，4種蛋白含量之和即為谷糠蛋白提取率[11]。

1.3.2 小米谷糠蛋白質含量及提取率的測定 小米谷糠中的蛋白質含量采用凱氏定氮法測定[12]，提取液中的蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定[13]。提取率的計算公式如下：

提取率=上清液中蛋白質含量原料中蛋白質含量×100%。

1.3.3 最佳酶的篩選 在各種蛋白酶的最適條件下提取小米谷糠蛋白（表1），篩選試驗用酶制劑[14]。

1.3.4 單因素試驗 分別測定加酶量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取pH值（8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）、提取溫度（40、45、50、55、60 ℃）4個因素對小米谷糠蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計 采用響應面軟件進行試驗設計，以A（加酶量）、B（溫度）、C（pH值）、D（時間）為4個因素，根據單因素試驗的結果選取3個水平進行試驗設計，試驗設計方案見表2[15]。

2 結果與分析

2.1 考馬斯亮藍曲線的繪制

以牛血清蛋白為標準品，進行考馬斯亮藍曲線的繪制，結果見圖1。

2.2 酶的篩選結果分析

由圖2可知，按提取率由高到低排序為堿性蛋白酶>復合蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>酸性蛋白酶，其中堿性蛋白酶的提取率達70.9%，因此本試驗選擇堿性蛋白酶作為酶制劑。

2.3 單因素試驗結果分析

由圖3可知，隨著加酶量的增加，谷糠蛋白的提取率表現出先上升后趨于平緩的趨勢，當加酶量為0.6%時，谷糠蛋白的提取率較高，當加酶量大于0.6%時，谷糠蛋白的提取率無明顯變化?？紤]到經濟因素，選擇最適加酶量為0.6%。

由圖4可知，隨著提取時間的延長，谷糠蛋白的提取率逐漸上升，當提取時間大于1.5 h，提取率趨于平緩，因此選擇最適提取時間為1.5 h。

由圖5可知，pH值是影響酶活性的重要因素，適宜的pH值將促進酶與蛋白質的結合，使提取率升高，谷糠蛋白的提取率隨著pH值的升高而出現先上升后下降的趨勢，當pH值為9.0時，谷糠蛋白的提取率最高。

由圖6可知，谷糠蛋白的提取率隨著提取溫度的升高出現先上升后下降的趨勢，當提取溫度不斷增加時，蛋白質分子獲得更多的熱能，加速了蛋白質間的碰撞，使得提取率上升;當提取溫度大于 50 ℃ 時，會導致酶失活，因此提取率出現下降趨勢。

2.4 響應面試驗結果分析

響應面設計試驗結果見表3，其方差分析見表4。由表4可知，回歸模型具有極顯著性（P<0.000 1），其失擬性為0.286 9，結果表現為不顯著，可見該模型建立合理，能夠更好地預測試驗結果。影響提取率的因素排序為加酶量>提取時間>pH值>提取溫度。通過響應面軟件對米糠蛋白的提取率進行二次多項回歸擬合分析，得到關于谷糠蛋白提取率的方程：Y=71.38+3.91A+2.82B+0.18C+0.13D-0.37AB+0.18AC-0.23AD+0.73BC-0.18BD+0.11CD-5.45A2-3.79B2-5.21C2-3.15D2。

用Box-Behnken軟件對試驗結果進行分析，得到響應曲面圖和等高線圖。從堿性蛋白酶的4個提取因素（加酶量、提取時間、提取pH值、提取溫度）對小米谷糠蛋白提取率影響的等高線和響應曲面可以看出，三維響應曲面越陡，說明該條件對提取率的影響越明顯，二維等高線越扁平，說明該條件的交互作用越明顯。由圖7至圖9可以看出，4種條件對小米谷糠蛋白提取率的影響大小為加酶量>提取時間>pH值>提取溫度。

3 討論

根據響應面試驗設計得到如下米糠蛋白提取率的最佳工藝條件：堿性蛋白酶用量為0.67%，提取時間為1.68 h，提取溫度為49.99 ℃，pH值為9.02，相應的理論提取率為72.57%?？紤]到實際操作，對最佳工藝條件進行修正后的加酶量為0.7%，提取時間為1.7 h，提取溫度為50 ℃，pH值為9.0，根據該條件進行3次平行試驗并取平均值，得到谷糠蛋白提取率為72.29%，與理論提取率72.57%間的誤差小于1，說明該試驗結果有效。

4 結論

本試驗結果表明，堿性蛋白酶是提取小米谷糠蛋白的最優(yōu)蛋白酶。采用超聲波輔助酶法提取小米谷糠中的蛋白質，并采用響應面設計法，利用Design-Expert軟件研究加酶量、提取時間、提取pH值和提取溫度對提取率的影響。經試驗得到最優(yōu)提取條件組合為加酶量為0.7%，提取時間為 1.7 h，提取溫度為50 ℃，pH值為9.0，實際提取率為72.29%。

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