竹菌的天然抗氧化活性初探

程依婷 范集壯 張朝志 佘 容* 楊曉燕

（1大理大學(xué)天然抗氧化劑和抗氧化炎癥研究院，云南大理671003；2中國(guó)三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理671003；3大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南大理671003；4大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理671003）

氧化應(yīng)激是指在體內(nèi)外有害因素刺激下，體內(nèi)自由基增加或機(jī)體抗氧化保護(hù)能力減弱，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[1]。人體的新陳代謝本身就是一個(gè)氧化過程，機(jī)體自身的老化過程、炎癥的發(fā)生以及環(huán)境污染、紫外線、農(nóng)藥殘留、汽車尾氣、微波等外界刺激都會(huì)導(dǎo)致人體產(chǎn)生過多的自由基。自由基過多會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致代謝異常[2]。研究表明，癌癥、衰老和部分其他疾病的產(chǎn)生都與過量自由基有一定的關(guān)聯(lián)，甚至被認(rèn)為是引起突變、誘發(fā)癌癥的重要原因[3]。許多疾病如心腦血管疾病、免疫反應(yīng)疾病等，也主要是由于人體內(nèi)過量的自由基引發(fā)氧化應(yīng)激，從而造成細(xì)胞損傷。因此，維持體內(nèi)適當(dāng)?shù)难趸€原平衡，對(duì)人體健康尤為重要[4-5]?？寡趸瘎┠芡ㄟ^清除自由基降低人體內(nèi)化合物氧化速率，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用[6]，而大型真菌中有許多種類都具有顯著的抗氧化活性[7-8]，其開發(fā)利用正是當(dāng)前天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)。

竹菌Engleromycis goetzii，又名肉球菌，是子囊菌綱、肉座菌科、肉球菌屬的一種真菌，是云南、四川、西藏等地具有悠久歷史的民族藥。竹菌具有抗菌消炎作用，目前正廣泛用于治療喉炎、扁桃體炎、胃潰瘍和急性腎炎等[8-9]。但關(guān)于竹菌化學(xué)成分的研究報(bào)道很少，其治療作用機(jī)理也尚不明確，僅有推測(cè)其可能是與自由基清除有關(guān)。因此，筆者以竹菌為研究對(duì)象，通過DPPH、ABTS和FRAP 3種方法測(cè)定其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸餾水提取物的抗氧化活性，評(píng)估竹菌天然抗氧化潛能，為其藥物開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

竹菌采摘于云南云嶺拉沙山自然保護(hù)區(qū)。

圖1 竹菌

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），LG10-2.4A高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），722N可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司），PX224ZH電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

1.2.2 試劑

1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH，分析純，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），2，2-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯井噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，分析純，上海麥克林生化科技有限公司），2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，分析純，上海麥克林生化科技有限公司），抗壞血酸（VC）、無(wú)水乙酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙酸乙酯（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），冰醋酸（分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研發(fā)開發(fā)中心），石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 竹菌提取物制備

將曬干的竹菌粉碎，過孔徑180um篩。準(zhǔn)確稱取竹菌粉50 g入500 mL錐形瓶，按料液比1∶10加入石油醚500 mL，20℃、60%功率、40 Hz超聲浸提1 h，避光靜置24 h后，用移液吸出上清，抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并經(jīng)冷凍干燥后即為石油醚提取物，4℃保存?zhèn)溆肹10]；沉淀于40℃烘干后再依次加入乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和蒸餾水，重復(fù)上述過程。最終分別獲得石油醚提取物（EPEE）、乙酸乙酯提取物（EEAE）、正丁醇提取物（ENE）、95%乙醇提取物（EAE）和蒸餾水提取物（EDWE）。

1.3.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：量取1 g/L的DPPH母液60 mL，用乙醇定容至50 mg/L以作工作液，置于冰箱中避光保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)，用乙醇稀釋至0μg/L，5×103μg/L，10×103μg/L，15×103μg/L，20×103μg/L，25×103μg/L，并在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各質(zhì)量濃度DPPH溶液吸光度，以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線[11-13]。

樣本DPPH自由基清除率測(cè)定：準(zhǔn)確稱取提取物干粉，并以甲醇（或水）為溶劑，配制成不同質(zhì)量濃度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的樣品作為試驗(yàn)組，分別取2 mL樣品，1∶1加入50 mg/L DPPH工作液，同時(shí)以甲醇作為空白對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，1個(gè)對(duì)照，1個(gè)空白試驗(yàn)。將混合液搖勻，37℃避光水浴30 min后，于517 nm處測(cè)定其吸光度值，計(jì)算樣本自由基清除率及其半抑制量（IC50）[14]。

1.3.3 ABTS自由基清除率測(cè)定

將7 mmol/L的ABTS儲(chǔ)備液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液按照1∶1（V/V，mL）混勻，25℃避光反應(yīng)12～16 h，得ABTS自由基母液。用無(wú)水乙醇稀釋ABTS自由基母液40倍得ABTS工作液，使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02[15-17]。

準(zhǔn)確稱取提取物干粉用甲醇（或水）為溶劑，配制成不同質(zhì)量濃度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的樣品液作為試驗(yàn)組，分別取2 mL樣液，1∶1加入ABTS工作液，并以甲醇作為空白對(duì)照，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，1個(gè)對(duì)照，1個(gè)空白試驗(yàn)。將混合液搖勻，避光反應(yīng)6 min，立即在734 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，計(jì)算其自由基清除率，并以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，ABTS自由基清除率為縱坐標(biāo)繪制曲線圖。

1.3.4 FRAP總氧化還原能力測(cè)定

0.3 mol/L pH 3.6醋酸緩沖液配制：稱取0.32 g無(wú)水醋酸鈉加入3.36 mL冰乙酸中并用蒸餾水定容至200 mL，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至3.6。10 mmol/L TPTZ溶液配制：稱取0.078 g TPTZ用40 mmol/L HCl溶液定容至25 mL。20 mmol/L FeCl3配制：稱取0.2 705 g FeCl3·6H2O用蒸餾水定容至50 mL。將以上溶液以10∶1∶1的比例混合即為FRAP總抗氧化能力測(cè)定工作液，所有溶劑需現(xiàn)配現(xiàn)用[18-19]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用去離子水配制FeSO4溶液（濃度為0.1 mmol/L，0.2 mmol/L，0.4 mmol/L，0.8 mmol/L，1.6 mmol/L），按照上述方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，再以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣本總氧化還原能力測(cè)定：準(zhǔn)確稱取提取物干粉，用甲醇（或水）為溶劑，配制成不同質(zhì)量濃度（15 g/L，10 g/L，5 g/L，2.5 g/L，1.25 g/L，0.625 g/L）的樣品液。檢測(cè)時(shí)，先在反應(yīng)管中加入150μL樣品液，再加入3.6 mL工作液，混勻后于37℃條件下水浴10 min。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)同時(shí)以去離子水為空白對(duì)照，VC為陽(yáng)性對(duì)照，水浴后于593 nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

DPPH/ABTS自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

式中：Ai為樣液+DPPH/ABTS工作液的吸光度；Aj為樣液+無(wú)水甲醇的吸光度；Ac為DPPH/ABTS工作液+無(wú)水甲醇的吸光度[15]。

IC50計(jì)算：根據(jù)竹菌提取物DPPH/ABTS自由基清除率與濃度曲線所得回歸方程，計(jì)算得到竹菌提取物將自由基原始質(zhì)量濃度減少至50%時(shí)的使用濃度。

比活性計(jì)算：A（%）=A1/A2

其中A表示比活性，A1表示VC的IC50，A2表示樣品的IC50。比活性越大，表明其抗氧化活性越強(qiáng)。

樣本總氧化還原能力計(jì)算：以1 mmol/L的FeSO4的吸光值為標(biāo)準(zhǔn)吸光值，當(dāng)樣品抗氧化活性達(dá)到同樣吸光值時(shí)為一個(gè)FRAP值[20]。FRAP值計(jì)算：FRAP（mmd）=（Ai-Aj）/A0

其中，Ai為樣本吸光值；Aj為對(duì)照吸光值；A0為標(biāo)準(zhǔn)吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

對(duì)DPPH溶液質(zhì)量濃度（C）和吸光度（A）做線性回歸，擬合變化趨勢(shì)。其線性回歸方程為y=0.008 5x+0.001 4，R2=0.999 7。

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸餾水提取物均具有DPPH自由基清除能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，自由基清除能力先上升，后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。但不同溶劑提取物的清除能力存在差異：在提取劑質(zhì)量濃度為0.625～15 g/L時(shí)，蒸餾水提取物的清除效果最好（IC50=1.297，比活性為0.463%），其次是乙酸乙酯提取物（IC50=2.948，比活性為0.204%），再次是95%乙醇提取物（IC50=5.848，比活性為0.103%）和正丁醇提取物（IC50=8.836，比活性為0.068%），效果最差的是石油醚提取物（IC50=25.491，比活性為0.024%）。其中，比活性最大的為最小的19.292倍（表1）（圖2）。

表1 不同溶劑提取物自由基清除能力

圖2 竹菌不同溶劑提取物的DPPH自由基清除率

2.2 ABTS自由基清除能力

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸餾水提取物均具有清除ABTS自由基清除能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，自由基清除能力先上升，后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。但不同溶劑提取物的清除效果也存在差異：在提取劑質(zhì)量濃度為0.625～15 g/L時(shí)，95%乙醇提取物的清除效果最好（IC50=0.378，比活性為0.793%），其次是蒸餾水提取物（IC50=0.546，比活性為0.549%），再次是乙酸乙酯提取物（IC50=0.710，比活性為0.423%）和正丁醇提取物（IC50=1.149，比活性為0.261%），效果最差的是石油醚提取物（IC50=4.289，比活性為0.070%）。其中，比活性最大的為最小的11.329倍（表1）（圖3）。

圖3 竹菌不同提取物的ABTS自由基清除能力

2.3 總氧化還原能力

以吸光度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.601 2x+0.0429，R2=0.9937。

竹菌的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇及蒸餾水提取物均具有氧化還原能力，且隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，氧化還原能力先上升，后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。但不同溶劑提取物的清除效果存在差異：在提取物質(zhì)量濃度為0.625～15 g/L時(shí)，竹菌不同溶劑提取物的氧化還原能力隨FeSO4濃度增加而升高。FeSO4質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，石油醚提取物的總氧化還原能力最強(qiáng)（2.77±0.030），其次是乙酸乙酯提取物（2.14±0.030），再次是正丁醇提取物（1.52±0.002）和蒸餾水提取物（0.867±0.006），效果最差的是95%乙醇提取物（0.75±0.006）。其中，還原能力最大的為最小的3.693倍。

圖5 竹菌不同提取物的總氧化還原能力

3 小結(jié)與討論

天然產(chǎn)物成分中，萜類、甾體等大環(huán)、稠環(huán)化合物極性小，易溶于石油醚、乙酸乙酯等親脂性溶劑，而糖、苷等極性較大物質(zhì)易溶于水、乙醇等溶劑中，因此，采用不同溶劑進(jìn)行竹菌成分提取所得產(chǎn)物，其所含功能分子應(yīng)是不同的[21]。因此，選擇5種不同極性溶劑進(jìn)行竹菌抗氧化活性成分的提取，研究結(jié)果證明其在三個(gè)指標(biāo)的評(píng)估中均顯示有抗氧化活性。

另一方面，分別采用3種方法對(duì)竹菌的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)估，研究結(jié)果顯示，不同方法測(cè)定結(jié)果中，5種提取物的抗氧化活性排序是存在差異的。DPPH法測(cè)得抗氧化活性由高到低依次為蒸餾水提取物＞乙酸乙酯提取物＞95%乙醇提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物；ABTS法測(cè)得抗氧化活性由高到低依次為95%乙醇提取物＞蒸餾水提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物；FRAP法測(cè)得抗氧化活性由高到低依次為石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞蒸餾水提取物＞95%乙醇提取物。究其原因，可能是因?yàn)椋海?）DPPH法和ABTS法均是針對(duì)自由基清除能力設(shè)定的評(píng)估指標(biāo)，但因?yàn)锳BTS自由基較DPPH自由基反應(yīng)更容易，且二者清除原理不同，因此，反映出的自由基清除能力也不同[22]；（2）FRAP法測(cè)定的是竹菌活性成分的氧化還原能力，原理自然不同與DPPH法和ABTS法[24]，因此，F(xiàn)RAP法測(cè)定結(jié)果與前兩種方法完全不一致。由此可見，不同的分析方法對(duì)應(yīng)不同的抗氧化原理，在天然產(chǎn)物抗氧化活性評(píng)估中結(jié)合多種指標(biāo)進(jìn)行研究是必要的。

首次對(duì)竹菌抗氧化活性潛能進(jìn)行評(píng)估，分析結(jié)果顯示，5種不同極性有機(jī)溶劑提取所得產(chǎn)物均具有抗氧化能力，可用于抗氧化劑開發(fā)。同時(shí)，竹菌為可食用真菌，使得其在開發(fā)利用方面天生就具有安全優(yōu)勢(shì)，未來可用于諸多領(lǐng)域，如具有清熱解毒和抗氧化功能的飲品，食品保鮮劑，化妝品的抗衰老精華添加劑，抗炎癥、預(yù)防癌癥、預(yù)防腫瘤、抗氧化功能的新藥等[23-24]。因此，在未來的研究中計(jì)劃進(jìn)一步采用高效液相色譜分離純化體外抗氧化活性較好的提取物—乙酸乙酯及蒸餾水提取物中的有效成分，并通過細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其抗氧化活性及安全性[25]。