王婷婷 鄭學香 曾真 李婷婷

(湖北民族大學附屬荊門市第一人民醫(yī)院體檢科，湖北 荊門 448000)

肺癌是全球癌癥死亡的最主要原因。近年來，盡管肺癌的早期診斷和靶向治療技術不斷發(fā)展，但整體5年生存率仍然很低〔1〕。因此，開發(fā)新的有效的肺癌治療方法迫在眉睫。順鉑是治療肺癌的有效藥物，但由于順鉑耐藥性的出現(xiàn)導致肺癌患者預后不良〔2〕。最近，天然化合物的抗腫瘤作用引起了研究者的關注〔3〕。白毛藤為茄科植物白英的全草，具有清熱利濕，祛風解毒之功效。研究發(fā)現(xiàn)，白毛藤多糖對乳腺癌〔4〕、胰腺癌〔5〕等惡性腫瘤具有抑制作用，但白毛藤多糖在肺癌中的作用鮮有報道。miR-1270是一種致癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，miR-1270在膀胱癌等惡性腫瘤中表達上調，干擾其表達可抑制癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔6〕。細胞周期蛋白(CCN)G2是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)，CCNG2在結腸癌組織中表達下調，過表達CCNG2抑制結直腸癌細胞的增殖〔7〕。有研究〔8〕報道，桑色素通過調控miR-135b/CCNG2表達抑制肺癌細胞的活力、克隆形成及遷移能力。但白毛藤多糖和miR-1270對肺癌細胞增殖、凋亡的影響及miR-1270和CCNG2的靶向關系，且白毛藤多糖是否通過調控miR-1270/CCNG2通路影響肺癌細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。本研究旨在揭示白毛藤多糖調控miR-1270/CCNG2通路對肺癌細胞增殖和凋亡的影響和機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人肺癌細胞株A549購于美國ATCC；DMEM培養(yǎng)液購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購于Invitrogen公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購于碧云天公司；TRIzol試劑、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒和Western印跡相關試劑購于北京索萊寶公司；miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、anti-miR-1270、pcDNA、pcDNA-CCNG2、miR-NC、miR-1270、野生型(WT)-CCNG2和突變型(MUT)-CCNG2構建和測序及PCR引物由北京華大基因公司提供；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl相關X蛋白(Bax)抗體和CCNG2抗體及二抗均購于Abcam公司。

1.2細胞培養(yǎng)和轉染 人肺癌細胞株A549培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基液中，置于37℃、含5% CO2、濕度飽和的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的A549細胞按每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，利用LipofectamineTM2000將anti-miR-NC、anti-miR-1270、pcDNA和pcDNA-CCNG2分別轉染A549細胞，培養(yǎng)48 h后檢測轉染效果，隨后進行后續(xù)實驗。

1.3實驗分組 A549細胞分組如下：對照組(DMSO處理A549細胞)、白毛藤多糖組(分別用終濃度為0.4、0.8和1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理A549細胞48 h)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-1270組(轉染anti-miR-1270)、pcDNA組(轉染pcDNA)和pcDNA-CCNG2組(轉染pcDNA-CCNG2)、白毛藤多糖+miR-NC組(轉染miR-NC后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理48 h)和白毛藤多糖+miR-1270組(轉染miR-1270后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理48 h)。

1.4MTT實驗 取按照1.3分組進行相應處理的各組對數(shù)期細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml，按照每孔100 μl接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，加入20 μl的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩10 min，當結晶溶解后，用酶標儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值(A值)。根據(jù)A值計算細胞抑制率(IR)，IR(%)=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別收集按照1.3分組處理至規(guī)定時間的A549細胞，離心后棄去上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸A549細胞后，再次離心棄去上清液。用適量的1×結合緩沖液重懸A549細胞，使其濃度約1×105個/ml，每管加入100 μl細胞懸液，加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后，再加入10 μl的PI，室溫避光孵育15 min后，加入400 μl的1×結合緩沖液混勻后，用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。

1.6qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑分別提取各組A549細胞的總RNA，檢測其濃度和純度。利用逆轉錄酶合成cDNA后，進行qRT-PCR擴增。分別以U6和GAPDH為內源性參照，用2-ΔΔCt法計算miR-1270和CCNG2 mRNA的相對表達量。實驗用引物序列：miR-1270上游引物5′-CTGGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′，下游引物5′-TGCAAAGAGCCACATAGAAGAT-3′，U6上游引物5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，下游引物5′-CTGCTTCATGA-TCGTTGTTGCTTG-3′，CCNG2上游引物5′-CTTTGGGCATTATTAGGA-3′，下游引物5′-GAGGAGGAAACAGTAGCAG-3′，GAPDH上游引物為5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAA-C-3′，下游引物為5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。

1.7Western印跡檢測 利用RIPA裂解液裂提取各組A549細胞的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度。按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-電化學發(fā)光(ECL)顯色步驟進行，最后利用Image J 軟件對目的條帶灰度值進行分析。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測 利用生物信息軟件預測miR-1270的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-1270與CCNG2的3′UTR存在部分連續(xù)結合位點，猜測CCNG2是miR-1270的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。構建WT-CCNG2和MUT-CCNG2的CCNG2-3′UTR熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000將miR-1270模擬物和miR-NC分別與WT-CCNG2和MUT-CCNG2共轉染A549細胞，培養(yǎng)48 h后，測定各組人胃腺癌細胞(AGS)細胞的熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與對照組相比，白毛藤多糖組A549細胞的增殖抑制率和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，隨著白毛藤多糖濃度增加，對A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用顯著增強，各濃度組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

圖1 細胞凋亡流式圖

圖2 白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響

2.2白毛藤多糖對肺癌A549細胞中miR-1270和CCNG2表達的影響 與對照組相比，白毛藤多糖組A549細胞中miR-1270的表達顯著降低，CCNG2 mRNA和CCNG2蛋白的表達顯著增加(P<0.05)。隨著白毛藤多糖濃度增加，對miR-1270表達的抑制和CCNG2表達的促進作用明顯增強，各濃度組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 CCNG2蛋白表達

表2 白毛藤多糖對肺癌A549細胞中miR-1270和CCNG2表達的影響

2.3miR-1270靶向調控CCNG2的表達 miR-1270的5′端與WT-CCNG2的3′UTR存在部分特異性結合為位點。見圖4。

圖4 CCNG2的3′UTR中含有與miR-1270互補的核苷酸序列

如表3所示，當上調miR-1270表達后，轉染W(wǎng)T-CCNG2的3′UTR的熒光素酶報告基因載體的A549細胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而轉染MUT-CCNG2的3′UTR的熒光素酶報告基因載體的A549細胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。當上調miR-1270表達后，A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著降低〔miR-NC組(0.64±0.06)vs miR-1270組(0.25±0.03)，P<0.05〕；當下調miR-1270表達后，A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著升高〔anti-miR-NC組(0.63±0.06)vs anti-miR-1270組(0.97±0.09)，P<0.05〕。以上結果表明，CCNG2是miR-1270的靶基因，miR-1270可負性調控CCNG2的表達。見圖5。

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-1270組，anti-miR-NC組，anti-miR-1270組

2.4抑制miR-1270表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1270組A549細胞miR-1270的表達顯著降低(P<0.05)，表明穩(wěn)定抑制miR-1270表達的A549細胞株構建成功。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1270組A549細胞的增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高(均P<0.001)，見圖6、表5。表明，抑制miR-1270表達可抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡。

圖6 anti-miR-NC組與anti-miR-1270組增殖凋亡相關蛋白表達

表5 抑制miR-1270表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

2.5CCNG2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-CCNG2組A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著升高(P<0.001)，表明過表達CCNG2的A549細胞株構建成功。與pcDNA組相比，pcDNA-CCNG2組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高(均P<0.001)，見圖7、表6。表明，CCNG2過表達可抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡。

2.6miR-1270過表達逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用 與對照組比較，白毛藤多糖組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高；與白毛藤多糖+miR-NC比較，白毛藤多糖+miR-1270組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著降低，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著升高，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著降低(均P<0.001)。表明，過表達miR-1270逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。見表7、圖8。

圖7 CCNG2和增殖、凋亡相關蛋白表達

表6 CCNG2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

表7 miR-1270過表達逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用

1～4：對照組，白毛藤多糖組，白毛藤多糖+miR-NC組，白毛藤多糖+miR-1270組

3 討 論

肺癌是由癌細胞的增殖失控引起的復雜疾病，癌基因的過度表達和抑癌基因的功能喪失是導致肺癌發(fā)生發(fā)展的主要原因〔9〕。盡管化療對肺癌等實體瘤具有顯著的臨床活性，但固有和獲得性耐藥的出現(xiàn)大大降低了化療藥物的應用〔10〕。因此，從天然化合物中尋找一種經(jīng)濟、安全、高效的抗癌藥物是抗癌藥物研發(fā)的主要目標。

白毛藤作為我國一種傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗菌、抗過敏、肝臟保護、增強免疫力和抗腫瘤等多種藥理活性〔11〕。白毛藤參與調控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Lin等〔12〕在研究白毛藤提取物的體外抗癌分子機制時發(fā)現(xiàn)，白毛藤提取物可促使骨肉瘤細胞形態(tài)學改變，抑制細胞存活，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。Liu等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)白毛藤總皂苷對宮頸癌細胞Hela具有增殖抑制作用，并通過多途徑誘導Hela細胞凋亡。此外，白毛藤提取物還可顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，促進脾細胞增殖，增強自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞(CTL)活性，改善免疫反應進而表現(xiàn)出抗腫瘤活性〔14〕。本研究中通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，白毛藤多糖可顯著抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡。同時，發(fā)現(xiàn)白毛藤多糖可顯著抑制A549細胞中miR-1270的表達，促進CCNG2的表達。此外，本實驗結果表明miR-1270可負性調控CCNG2的表達。推測白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路而發(fā)揮作用。

miR-1270是一種保守性較差的miRNA。研究證實，miR-1270可以與干擾素α1和其性質的反義mRNA的相互作用以調節(jié)體內穩(wěn)態(tài)〔15〕。此外，miR-1270在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。Zhong等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-1270在骨肉瘤組織和細胞中高表達，通過慢病毒技術干擾miR-1270表達可抑制骨肉瘤細胞的體外增殖和遷移，且miR-1270高表達與診斷時患者的遠處轉移和高級別腫瘤顯著相關。Yi等〔17〕研究表明，miR-1270在甲狀腺癌細胞系和組織中異常上調，miR-1270通過靶向調控SCAI表達促進甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和體內移植。在肺癌中，miR-1270被認為與表觀遺傳調節(jié)因子組蛋白去乙?；?HDAC)4相關〔18〕，但關于miR-1270在肺癌中作用機制并未有詳細報道。CCNG2作為一種腫瘤抑制因子，具有調節(jié)細胞生長和增殖的作用，其表達量的降低與多種惡性腫瘤類型有關〔19〕。Gao等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中CCNG2表達水平降低，且與腫瘤大小、遷移和分化狀態(tài)差有關，過表達CCNG2抑制了腫瘤的生長和轉移。CCNG2在甲狀腺癌組織也呈低表達，過表達CCNG2能夠抑制甲狀腺癌SW579細胞的增殖并促進其凋亡〔21〕。本研究證實抑制miR-1270或過表達CCNG2均可顯著抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡，過表達miR-1270逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，表明在肺癌細胞中，白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路可抑制肺癌細胞增殖，促進細胞凋亡。白毛藤多糖是一種有效的肺癌治療藥物，本研究的發(fā)現(xiàn)為白毛藤多糖在肺癌臨床治療中的開發(fā)應用提供了理論依據(jù)。