高效液相直接進(jìn)樣法測定葡萄酒中的莧菜紅和胭脂紅

◎ 王麗君

（常州市武進(jìn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇 常州 213164）

葡萄酒具有良好的保健作用，深受廣大消費(fèi)者喜愛。普通葡萄酒不含人工色素，紅葡萄酒的顔色主要來源于葡萄皮中的一種“花青苷”。為增加葡萄酒的色澤，部分商家會(huì)添加一些色素來達(dá)到效果，尤其是一些市售葡萄酒中常添加胭脂紅、莧菜紅等合成色素，這些合成色素具有一定的毒性（包括毒性、致瀉性和致癌性），其毒性來自合成色素中的砷、鉛、銅、苯酚、苯胺、乙醚、氯化物和硫酸鹽，對人體均可造成不同程度的危害[1]。目前對合成色素的檢測方法有薄層色譜法、示波極譜法、多波長分光光度法和高效液相色譜法等[2-8]。本文在參考國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上對高效液相法進(jìn)行改進(jìn)，以提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（日本島津LC-10ATvp、SPD10Avp紫外檢測器）；色譜柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；超聲波振蕩器。

甲醇（優(yōu)級純），0.02 mol·L-1的乙酸銨（分析純）。色素標(biāo)準(zhǔn)品：胭脂紅GBW（E）100004a（批號(hào)：14001）；莧菜紅GBW（E）100002a（批號(hào)：14001）；除另有說明外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)系列的配置

標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5 mg·mL-1，加純水將其稀釋至5.0 ng·μL-1作為使用液，用10 μL微量進(jìn)樣針分別于樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)量為0 ng、12.5 ng、37.5 ng、50.0 ng和75.0 ng，測定，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y軸截距即為樣品中被測物質(zhì)含量。

1.2.2 樣品前處理

樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后直接進(jìn)25 μL樣液測定。

1.2.3 色譜條件

色譜柱（CTO-10Asvp），填充物（C18）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為 1.0 mL·min-1，A 為甲醇，B 為0.02 mol·L-1乙酸溶液；進(jìn)樣量為25 μL；檢測過程中波長變換見表1，梯度洗脫設(shè)置見表2。

表1 波長程序表

表2 梯度洗脫程序表

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選定

根據(jù)各色素最大吸收波長和元素出峰時(shí)間設(shè)置時(shí)間波長程序可顯著提高被測物的靈敏度，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定》（GB/T 5009.35—2016）中要求二極管陣列檢測器的波長范圍為400～800 nm，紫外檢測器檢測波長為254 nm。本實(shí)驗(yàn)測定時(shí)，經(jīng)紫外檢測器掃描，確定莧菜紅在0～4 min測定時(shí)波長為520 nm，胭脂紅在4～11 min測定時(shí)波長為510 nm，在此檢測條件下，可提高待測物靈敏度，顯著減少樣品中干擾物質(zhì)的出峰，且出峰峰形更好。在此條件下，加標(biāo)樣品的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相葡萄酒加標(biāo)色譜圖

2.2 方法線性范圍、回收率、精密度、檢測限

在2.1實(shí)驗(yàn)條件下，得莧菜紅的線性回歸方程為y=2 057.7x+1 348.8，R2=0.999 0，胭脂紅的線性回歸方程為y=2 004.7x-69.21，R2=0.999 2。線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，方法的加標(biāo)回收率分別為95%和102%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.86%和6.84%，檢測限分別為 0.024 mg·L-1和 0.087 mg·L-1。

3 討論

3.1 波長程序的設(shè)定

每次開機(jī)測量時(shí)，各組分的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生變化，因此，每次實(shí)驗(yàn)前根據(jù)各組分的保留時(shí)間選擇合適的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以校正波長程序。在本實(shí)驗(yàn)中，以國家標(biāo)準(zhǔn)為參考，根據(jù)樣品的自身特點(diǎn)選擇合適的波長和波長程序。當(dāng)樣品分析的組分較多，基體較為復(fù)雜時(shí)波長程序的設(shè)定更為必要。

3.2 雙峰定量優(yōu)化

直接進(jìn)樣法測定時(shí)樣品基體復(fù)雜，色素在酒中可能會(huì)有部分轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加標(biāo)法中莧菜紅的標(biāo)準(zhǔn)曲線用雙峰（即圖1中的峰1和峰2的峰面積之和）組合作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)其線性更好，其回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，而單峰的相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 0，經(jīng)雙峰定量曲線計(jì)算，回收率為102.05%，經(jīng)單峰定量曲線計(jì)算，回收率為103.76%，表明雙峰定量具有一定的優(yōu)化性。

3.3 不同前處理方法比較

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去除酒中的乙醇可減少莧菜紅在酒中的轉(zhuǎn)化物。經(jīng)過趕乙醇處理的樣，其回收率明顯減小。但由于國家標(biāo)準(zhǔn)中沒有明確規(guī)定去除乙醇的時(shí)間和溫度，因此，在確保乙醇不揮干的基礎(chǔ)上進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)待測物質(zhì)仍有大量損失。由于葡萄酒中乙醇蒸發(fā)所需的時(shí)間較難控制，再加上損失的不確定性，省略蒸發(fā)這一操作步驟，回收率可得到優(yōu)化，具體檢測情況見表3。因此，本實(shí)驗(yàn)采取直接進(jìn)樣法進(jìn)行測定。

表3 葡萄酒不同前處理加標(biāo)回收率及精密度表

3.4 標(biāo)準(zhǔn)加入法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果比較

在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)同一樣品采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法與標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量，測得的結(jié)果存在差異，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得的樣品平均濃度低于標(biāo)準(zhǔn)加入法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法測得樣品加標(biāo)回收率為79.12%～88.23%，標(biāo)準(zhǔn)加入法測得的加標(biāo)回收率為89.32%～103.76%，標(biāo)準(zhǔn)加入法測得的加標(biāo)回收率明顯高于標(biāo)準(zhǔn)曲線法，則可證明標(biāo)準(zhǔn)加入法測得的結(jié)果更為準(zhǔn)確。由于食品類樣品基體一般較為復(fù)雜，但待測物含量低，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾較大，因此選擇標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測定，準(zhǔn)確度相對較高。

3.5 聚酰胺吸附

本次實(shí)驗(yàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行色素提取，發(fā)現(xiàn)用聚酰胺進(jìn)行吸附后，用解吸液解吸，聚酰胺上的色素難以完全洗脫，其標(biāo)準(zhǔn)回收率為75.43%～85.16%，低于直接進(jìn)樣法。因此本實(shí)驗(yàn)采用直接進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)加入法，可省去煩瑣的前處理步驟，提高方法的準(zhǔn)確度，減少有機(jī)溶劑對環(huán)境和人員的危害。

3.6 曲線回歸比較

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對分別濃度配制法和一瓶濃度遞增法進(jìn)行曲線回歸比較，其結(jié)果差距相對較小。分別濃度配制法：分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液2.5 μL、7.5 μL、10.0 μL、12.5 μL于10 mL容量瓶中，用樣品液定容后測定。一瓶濃度遞增法：準(zhǔn)確移取2.5 μL標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中，用樣品液定容至10 mL，混勻，取25 μL進(jìn)樣測定，即得除空白外的第1點(diǎn)的色譜圖，向容量瓶內(nèi)加5.0 μL標(biāo)準(zhǔn)使用液，混勻后測定為第2點(diǎn)，同此法分別加入2.5 μL，得第3點(diǎn)和第4點(diǎn)，即得與分別配制法相同的濃度系列。一瓶濃度遞增法使用的實(shí)驗(yàn)器具較少，減少了操作步驟，簡單方便，對于原子吸收、氣相色譜、質(zhì)譜儀等大型精密儀器均可參考使用。

4 結(jié)論

本文參照國家標(biāo)準(zhǔn)對葡萄酒中莧菜紅、胭脂紅進(jìn)行測定，解決了實(shí)際操作中遇到的一系列問題，對測試條件、樣品處理、數(shù)值的定量進(jìn)行合理改進(jìn)，提高方法精密度和準(zhǔn)確度，可應(yīng)用于酒類樣品中人工合成色素的測定。