郭志新, 李 航, 秦偉捷

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 國家蛋白質(zhì)科學中心(北京), 蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室, 北京 102206)

氧連接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,它廣泛參與機體的眾多生命活動,而其穩(wěn)態(tài)的破壞與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等[1-7]。大規(guī)模富集鑒定O-GlcNAc修飾蛋白有助于深度挖掘其生物學功能及相關(guān)疾病機制。由于O-GlcNAc糖基化修飾豐度低、形成的糖苷鍵不穩(wěn)定等[8],O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定面臨一定挑戰(zhàn)。因此,發(fā)展高效的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段富集鑒定新方法是對其深入研究的關(guān)鍵。

非天然糖代謝標記技術(shù)作為蛋白質(zhì)糖基化研究的通用技術(shù)被廣泛應用于O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[9-12]。非天然糖通常攜帶一個生物正交化學報告基團(如疊氮),其親水性羥基常以疏水性的乙酰基包裹保護,從而增強非天然糖的細胞攝取。全乙酰化的非天然糖進入細胞后通過細胞內(nèi)糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為相應底物尿苷二磷酸-氮乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAz),進而被O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)識別并整合在目標蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸羥基上，隨后可通過特異性的生物素探針捕捉目標蛋白質(zhì),實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化修飾蛋白/肽段的富集鑒定[13]。然而,最新研究表明,在細胞代謝標記過程中,全乙?；姆翘烊惶菚瑫r標記半胱氨酸的巰基而產(chǎn)生半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物[14-17],并且在蛋白質(zhì)或肽段層面的O-GlcNAc糖基化修飾鑒定結(jié)果中,難以排除副反應產(chǎn)物半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的干擾。因此,建立一種特異性去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法具有十分重要的意義。

近年來,三甲基苯磺酰羥胺(MSH)被廣泛應用于蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。MSH是一種氧化及胺化試劑,它可以提供游離的氨基以進攻硫醚中的親核性硫原子,在一定堿性條件下轉(zhuǎn)化為亞硫亞胺中間體,進而發(fā)生消除反應生成烯烴產(chǎn)物[18]。Davis課題組[19]在pH=8的溫和體系下,利用MSH氧化消除絲氨酸蛋白酶突變體S-乙基半胱氨酸中的硫醚鍵,成功將其轉(zhuǎn)化為脫氫丙氨酸。隨后,MSH氧化消除法又被成功應用于半胱氨酸巰基-微囊藻毒素修飾物中硫醚鍵的斷裂[20]。在此基礎(chǔ)上,本研究發(fā)展了MSH特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Ultrafle Xtreme MALDI TOF/TOF基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜儀(Bruker公司,德國), EASY Nlc 1 200 Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀、HERAcell VIOS 160i細胞培養(yǎng)箱、MSC-100 Thermo-Shaker恒溫振蕩金屬浴、Micro 21微量離心機、Nano Drop 2000C超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司,美國), Concentrator Plus真空離心濃縮儀(Eppendorf公司,德國), Sartorius BP211d分析天平(Sartorius公司,德國), LX-200型迷你離心機(海門市其林貝爾儀器制造有限公司,江蘇)。

細胞低糖培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。O-GlcNAc水解酶抑制劑(Thiamet G)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購自美國Corning公司。二甲基亞砜(DMSO)購自北京百靈威科技有限公司。疊氮全乙?；肴樘前?Ac4GalNAz)、核質(zhì)蛋白提取試劑盒、三苯基磷-生物素探針、鏈霉親和素磁珠和表面活性劑去除柱均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。十二烷基磺酸鈉(SDS)購自美國USB公司。MSH購自上海易恩化學技術(shù)有限公司。鹽酸三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl, 1 mol/L, pH=7.4)購自北京索萊寶科技有限公司。碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和乙基苯基聚乙二醇(NP-40)均購自德國Sigma Aldrich公司。磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鈉(NaCl)、碳酸鈉(Na2CO3)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為分析級或HPLC級,不經(jīng)額外純化直接使用。

1.2 MSH氧化消除反應的建立

1.2.1半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的制備

首先取30 μg巰基標準肽段溶于23 μL碳酸鈉緩沖液(25 mmol/L, pH=10)中,然后加入終濃度2 mmol/L的Ac4GalNAz,于37 ℃恒溫箱孵育90 min,然后經(jīng)C18柱脫鹽熱干備用,待MALDI-TOF MS分析。

1.2.2MSH氧化消除

將上述制備的半胱氨酸巰基人為修飾物復溶于15 μL磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8),測定濃度后取出4 μg加入磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

將1 μg疊氮標記的O-GlcNAc(N3-O-GlcNAc)標準肽段溶于磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)中,配至終體積40 μL,取出5 μL作為實驗對照組備用。

剩余樣品中分別加入終濃度15 mmol/L的MSH,于室溫快速渦旋1 min后,隨后置于95 ℃避光振蕩反應30 min,反應前后均采用MALDI-TOF MS進行分析。

1.3 Hela細胞中O-GlcNAc修飾肽段的富集

1.3.1Hela細胞代謝培養(yǎng)

待Hela細胞生長狀態(tài)良好時進行代謝培養(yǎng):在10 mL細胞低糖培養(yǎng)基中加入終濃度100 μmol/L的Ac4GalNAz,再加入終濃度10 μmol/L的Thiamet G備用。移去Hela細胞的原培養(yǎng)基,用PBS清洗細胞兩次,加入配制的低糖培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

1.3.2核質(zhì)蛋白提取及酶切

收集的細胞于4 ℃以2 000 g離心3 min后移去上清液,使用核質(zhì)蛋白提取試劑盒提取核質(zhì)蛋白。首先向細胞加入1 000 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑I,以2 500 r/min渦旋15 s懸浮沉淀,于冰上放置10 min后加入55 μL細胞質(zhì)蛋白提取試劑II,以2 500 r/min渦旋5 s,再于冰上放置1 min,以2 500 r/min渦旋5 s,隨后于4 ℃以16 000 g離心5 min,轉(zhuǎn)移上清胞質(zhì)提取物至離心管。在剩下的組分中加入500 μL細胞核蛋白提取試劑,以2 500 r/min渦旋15 s,冰上放置10 min,重復操作4次,于4 ℃以16 000 g離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至離心管,合并兩次上清液,即為核質(zhì)蛋白。

將提取的核質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)移至10 kDa超濾管,以14 000 g離心15 min,用50 mmol/L NH4HCO3溶液清洗4次,檢測蛋白質(zhì)濃度。在核質(zhì)蛋白中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1∶50),于37 ℃恒溫箱酶切16 h,酶切后以14 000 g離心10 min,收集肽段,并用水清洗超濾管兩次。收集的肽段于45 ℃真空熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3酶切肽段的氧化消除

熱干的肽段用磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)復溶,并測定其濃度。隨后將肽段溶液稀釋至1 μg/μL,取400 μL加入終濃度15 mmol/L的MSH,室溫快速渦旋1 min后于95 ℃避光振蕩反應30 min。反應完成后用C18柱脫鹽,于45 ℃真空熱干備用。

1.3.4N3-O-GlcNAc修飾肽段的富集及洗脫

取鏈霉親和素磁珠50 μL,棄去保護液,用300 μL PBS清洗4次,備用。熱干的肽段用100 μL PBS復溶,加入終濃度200 μmol/L的三苯基磷-生物素探針于37 ℃恒溫箱孵育過夜,標記N3-O-GlcNAc修飾肽段。使用0.5 mL表面活性劑去除柱去除未反應的三苯基磷-生物素探針。生物素標記后的肽段補加PBS至終體積672 μL,并加入28 μL含100 g/L SDS的水溶液,然后將其全部轉(zhuǎn)移至磁珠中,室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h,孵育結(jié)束后,棄去上清液。

稱取146.2 mg NaCl和70.9 mg Na2HPO4,溶于25 mL水中,并加入25 mL Tris-HCl，配制為緩沖液A;依次使用300 μL含0.2% (v/v)NP-40的緩沖液A、300 μL緩沖液A及300 μL水分別清洗磁珠2次;然后加入80 μL含0.15% (v/v)TFA的水溶液,于95 ℃煮10 min,取洗脫液于離心管中;繼續(xù)用80 μL含0.15% (v/v) TFA的水溶液及80 μL洗脫液TFA-ACN-H2O(1∶50∶49, v/v/v)分別清洗磁珠1次;洗脫液合并過C8膜后于45 ℃真空熱干,熱干后置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分析條件

1.4.1MALDI-TOF MS

將DHB溶于H3PO4-ACN-H2O(1∶29∶70, v/v/v)溶液,配制成25 mg/mL的DHB基質(zhì)溶液。將1 μL樣品及1 μL DHB基質(zhì)溶液混合點于靶板上后室溫干燥,采用陽離子反射模式在20 kV加速電壓下進行譜圖采集。

1.4.2LC-MS/MS

流動相A和B分別為含0.1%(v/v) FA的水溶液和FA-H2O-ACN (1∶19∶80, v/v/v)。富集的肽段用流動相A復溶,以600 nL/min通過C18反相分析柱(150 mm×0.15 mm, 1.9 μm)實現(xiàn)樣品分離。洗脫程序為:0～8 min, 6%B～12%B; 8～58 min, 12%B～30%B; 58～70 min, 30%B～40%B; 70～71 min, 40%B～95%B; 71～78 min, 95%B。

噴霧電壓設(shè)定為2.3 kV,質(zhì)譜分析的一級掃描范圍設(shè)置為300～1 400 Da,分辨率為120 000;質(zhì)譜的二級譜圖以數(shù)據(jù)依賴型掃描模式(DDA)進行采集,二級碎裂方式為高能誘導解離(HCD),能量設(shè)置為35%,離子注入時間為50 ms。

1.5 數(shù)據(jù)檢索

LC-MS/MS數(shù)據(jù)(Raw文件)使用MaxQuant(版本1.6.17.0)以UniProt人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(20207-2015.7.21)為參考進行檢索,檢索條件設(shè)置如下:蛋白水解酶設(shè)置為胰蛋白酶,最多允許兩個漏切位點。甲硫氨酸氧化(M),蛋白質(zhì)N-末端乙?；?生物素標簽(Biotin-N3-O-GlcNAc,m/z=994.391 1)以及半胱氨酸巰基人為修飾物消除(-H2S,m/z=-33.987 7)均設(shè)置為可變修飾。母離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為2.0×10-5mg/L,碎片離子的最大質(zhì)量容差設(shè)置為0.5 Da,蛋白質(zhì)和肽段譜圖匹配的假陽性率(FDR)水平均設(shè)置為1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的構(gòu)建

研究表明[14],在堿性條件下,全乙?；姆翘烊粏翁强苫谶~克爾加成原理與半胱氨酸的巰基發(fā)生反應,生成半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物?；诖?實驗采用碳酸鈉緩沖液(200 mmol/L, pH=10),利用Ac4GalNAz于37 ℃孵育巰基標準肽段90 min,構(gòu)建半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(見圖1a)。孵育產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析結(jié)果如圖1b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)被成功檢測。通常,Ac4GalNAz體外孵育巰基標準肽段的產(chǎn)物多為二乙?；腚装彼釒€基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694),在堿性條件下乙?；l(fā)生部分水解,而產(chǎn)生單乙酰化的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 422.683)。以上結(jié)果表明半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的成功構(gòu)建。

圖 1 (a)Ac4GalNAz孵育巰基肽段的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 1 (a) Reaction diagram of thiol peptide incubated with tetraacetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

2.2 半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的氧化消除

MSH作為一種氧化及胺化試劑,可潛在用于半胱氨酸巰基修飾物的氧化消除。在此基礎(chǔ)上,實驗將上述構(gòu)建的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物作為底物,探究MSH氧化消除反應的最佳反應條件。如圖2所示,在適宜的反應條件下,MSH可進攻半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的親核性硫原子,引發(fā)氧化消除反應,生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)。為了避免強烈的堿性條件對O-GlcNAc糖基化修飾的破壞,實驗首先確定了溫和的磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L, pH=8)體系,并且MSH在該體系下具有較高的熱穩(wěn)定性[21]。由于升高反應溫度有利于反應物分子吸收能量、促進反應的快速進行,實驗考察了不同反應溫度對MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的影響。實驗利用過量的MSH分別于4、20、50、80及95 ℃條件下處理半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果(見附表1,詳見http://www.chrom-China.com)顯示,在4、20和50 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)依舊有較高的信號強度,且未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物峰,說明反應未發(fā)生;在80 ℃反應30 min后,目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,表明氧化消除反應不完全;而在95 ℃反應30 min后,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物峰(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)完全消失,并且目標消除產(chǎn)物峰(m/z=1 102.604)顯示較高的信號強度,表明該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)已被完全氧化消除。上述實驗結(jié)果表明,當溫度達95 ℃時,MSH可較完全氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。實驗進一步在95 ℃條件下評估了MSH氧化消除反應的反應時長(見表1)。MALDI-TOF MS分析結(jié)果顯示,在95 ℃條件下縮短反應時間,目標消除產(chǎn)物(m/z=1 102.604)部分生成,但半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 464.694和m/z=1 422.683)仍存在,消除不完全(見附表2)。綜上,實驗采用95 ℃反應30 min的條件實現(xiàn)MSH快速高效地氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

圖 2 MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物機理Fig. 2 Mechanism of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with O-mesitylenesulfonylhydroxylamine (MSH)

表 1 MSH于不同條件下氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應結(jié)果

為了進一步驗證MSH氧化消除法的可行性,實驗制備了另一個半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750) (見附圖1),并利用MSH于95 ℃避光處理該半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物30 min,理論反應式如圖3a所示;反應后的譜圖如圖3b所示,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物(m/z=1 817.750)完全消失,并生成目標消除產(chǎn)物(m/z=1 455.661)。除此之外,圖3b顯示有未知峰(m/z=1 625.267)的生成,該物質(zhì)與推測的實驗潛在副產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量均不匹配(見附圖2)。由于反應體系復雜,未知峰(m/z=1 625.267)的化學分子式難以確定,猜測其是由消除產(chǎn)物衍生形成的副產(chǎn)物。但是,由于未知物(m/z=1 625.267)的相對分子質(zhì)量與半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物及相關(guān)乙?；夥宓南鄬Ψ肿淤|(zhì)量均不相同(見附圖3),該未知物的存在并不會干擾O-GlcNAc糖基化修飾的質(zhì)譜鑒定。綜上,MSH氧化消除法簡單可行,可高效去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。

圖 3 (a)MSH氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的反應式和(b)反應產(chǎn)物的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 3 (a) Reaction diagram of oxidative elimination of cysteine thiol-azidosugar artificial modification with MSH and (b) MALDI-TOF MS spectrum of reaction products

2.3 N3-O-GlcNAc修飾肽段的穩(wěn)定性考察

為了考察MSH氧化消除反應是否會同時破壞O-GlcNAc糖基化修飾,實驗選用了兩條含N3-O-GlcNAc修飾的標準肽段(m/z=1 333.758和m/z=1 354.707) (見附圖4)進行測試。兩條N3-O-GlcNAc標準肽段分別經(jīng)MSH在95 ℃條件下避光處理30 min,并采用MALDI-TOF MS分析。對比反應前、后的質(zhì)譜圖(見圖4),兩條N3-O-GlcNAc標準肽段峰經(jīng)MSH處理后仍穩(wěn)定存在,表明MSH氧化消除反應不會破壞N3-O-GlcNAc糖基化修飾。在后續(xù)復雜的生物代謝樣本中,半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物與O-GlcNAc糖基化修飾肽段同時存在,該策略可在消除巰基-疊氮糖人為修飾物的同時,進一步保證內(nèi)源O-GlcNAc糖基化修飾肽段在MSH氧化消除反應中的穩(wěn)定性。因此,MSH氧化消除法可以應用于細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的富集鑒定。

圖 4 兩條N3-O-GlcNAc肽段在MSH處理前、后的MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of two N3-O-GlcNAc peptides before and after treated with MSH

2.4 O-GlcNAc修飾肽段的精準鑒定

O-GlcNAc糖基化修飾是一種動態(tài)可逆的翻譯后修飾,它參與許多重要的生物信號通路。研究表明,細胞質(zhì)和細胞核中的多種蛋白質(zhì)會發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾[22,23]。為了深入了解O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的生物學功能,實驗選取Ac4GalNAz代謝Hela細胞后的核質(zhì)蛋白作為研究對象?；诤唵坞亩螌用?MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物方法的成功構(gòu)建,實驗利用MSH氧化消除核質(zhì)蛋白中的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,并鑒定到51條半胱氨酸巰基人為修飾消除產(chǎn)物肽段。該鑒定結(jié)果證明,在細胞代謝樣本中,MSH氧化消除法可以去除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的假陽性干擾,從而實現(xiàn)O-GlcNAc糖基化肽段的精準鑒定。最終,實驗利用生物素探針以及鏈霉親和素磁珠富集鑒定核質(zhì)蛋白中的N3-O-GlcNAc糖基化修飾肽段。通過質(zhì)譜鑒定分析,在3次重復實驗中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì)。進一步的基因本體分析顯示(見圖5),富集的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白主要分布于突觸后密度、細胞質(zhì)以及核染色體,主要參與細胞分裂、興奮性突觸后電位及微管運動等通路。其中,與轉(zhuǎn)移酶活性、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性以及微管結(jié)合等功能相關(guān)的O-GlcNAc糖基化修飾蛋白被顯著富集,與文獻[8,24,25]相符。以上結(jié)果表明,O-GlcNAc糖基化修飾蛋白廣泛分布于細胞不同區(qū)室,在機體的多項生命活動中發(fā)揮著重要作用。

圖 5 O-GlcNAc糖基化修飾蛋白的基因本體分析Fig. 5 Gene ontology analysis of O-GlcNAcylation proteinsP-value: significance level of enrichment.

3 結(jié)論

本研究發(fā)展了MSH特異性氧化消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物的方法,在保護O-GlcNAc糖基化修飾肽段的同時,特異性消除半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物。MSH氧化消除法操作簡單,反應高效。該方法被成功應用于消除Ac4GalNAz代謝Hela細胞中產(chǎn)生的半胱氨酸巰基-疊氮糖人為修飾物,最終在Hela細胞核質(zhì)蛋白中成功富集鑒定到157條O-GlcNAc修飾肽段,歸屬于130個蛋白質(zhì),并通過基因本體分析獲取了O-GlcNAc糖基化修飾蛋白潛在的生物學功能。本研究成功消除了全乙酰化非天然單糖細胞代謝產(chǎn)物中的副產(chǎn)物,去除了其對O-GlcNAc糖基化修飾肽段富集鑒定的干擾,實現(xiàn)了細胞中O-GlcNAc糖基化修飾肽段的精準富集鑒定,為非天然糖代謝標記技術(shù)在糖蛋白組學分析中的應用提供了新的研究策略。