丁 寧，王曉梅，徐世杰

（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

異常子宮出血（abnormal uterine bleeding，AUB）是婦科常見病，嚴(yán)重威脅婦女的身心健康，主要指與正常月經(jīng)的規(guī)律性、周期頻率、經(jīng)期出血量、經(jīng)期長(zhǎng)度任何1項(xiàng)不符的源自子宮的異常出血［1-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在育齡女性中，異常子宮出血的發(fā)病率高達(dá)10%～30%；在圍絕經(jīng)期患者的所有婦科問題咨詢中，異常子宮出血占70%以上［4，5］。異常子宮出血以其發(fā)病率高、病因復(fù)雜、治療尚不規(guī)范等特點(diǎn)，已經(jīng)成為臨床中極為棘手的問題。而中醫(yī)藥作為一種安全有效的治療手段，逐漸得到臨床醫(yī)生和患者的廣泛認(rèn)可［6］。

赤芍與牡丹皮配伍，赤芍散瘀血留滯，能清血分實(shí)熱，牡丹皮清熱涼血的作用較佳，既能清血分實(shí)熱，又能治陰虛發(fā)熱，二者合用，對(duì)于治療以血瘀和血熱為主要病機(jī)的婦科崩漏有較好的治療效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明赤芍與牡丹皮配伍能夠明顯改善血液流變學(xué)、凝血功能指標(biāo)、血小板系統(tǒng)等多項(xiàng)指標(biāo)，抑制血小板黏附率、增加血小板e(cuò) NOS、p-e NOS蛋白表達(dá)水平，具有較強(qiáng)的活血化瘀作用；藥學(xué)研究表明赤芍與牡丹皮合煎具有配伍合理性，能夠促進(jìn)有效成分的溶出，提高活血化瘀療效［8］。而赤芍-牡丹皮藥對(duì)也被廣泛應(yīng)用于異常子宮出血的治療，同時(shí)作用中藥處方或中成藥主要成分被指南推薦［9］。為進(jìn)一步深入研究赤芍-牡丹皮藥對(duì)異常子宮出血的作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，挖掘赤芍-牡丹皮藥治療異常子宮出血的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研發(fā)提供參考，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 赤芍-牡丹皮藥對(duì)的主要成分及作用靶點(diǎn)信息的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)——TCMSP數(shù)據(jù) 庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）查 找 赤芍-牡丹皮藥對(duì)的成分，并根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)篩選其中符合口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 的成分；通過文獻(xiàn)挖掘的方式對(duì)赤芍-牡丹皮藥對(duì)成分中不滿足上述藥動(dòng)學(xué)參數(shù)但具有藥理作用的成分進(jìn)行補(bǔ)充。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢出主要活性成分的作用靶點(diǎn)，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//uniprot.org/）得到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的基因號(hào)及標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.2 異常子宮出血疾病靶點(diǎn)的收集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）和TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp）等數(shù)據(jù)庫對(duì)異常子宮出血的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索和匯總，檢索關(guān)鍵詞為“abnormal uterine bleeding”。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過使用R軟件獲取赤芍-牡丹皮藥對(duì)與異常子宮出血共同靶點(diǎn)，繪制Venn圖，并將靶點(diǎn)信息輸入String平臺(tái)構(gòu)建可視化的蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病作用網(wǎng)絡(luò)圖搭建

使 用Cytoscape3.7.2 軟 件（http：//www.cytoscape.org/），將赤芍-牡丹皮藥對(duì)與異常子宮出血中藥物、成分、靶點(diǎn)、疾病之間的相互關(guān)系構(gòu)建可視化互作網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，從而使成分、靶點(diǎn)的重要性更加數(shù)據(jù)化，網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)分別代表了藥物、活性成分、基因靶點(diǎn)和疾病，連線代表上述節(jié)點(diǎn)之間的相互聯(lián)系。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

利 用Bioconductor（http：//www.bioconductor.org/）在線數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的靶標(biāo)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。以P＜0.05 作為條件進(jìn)行篩選，將前20條基因生物過程和信號(hào)通路利用在線工具將富集的通路進(jìn)行高級(jí)氣泡圖的可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 赤芍-牡丹皮藥對(duì)的主要活性化合物及作用靶點(diǎn)

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫初步檢索得到赤芍-牡丹皮藥對(duì)的活性成分共174個(gè)，其中赤芍119個(gè)，牡丹皮55個(gè)。根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（OB≥30%和DL≥0.18）篩選后共得到主要活性成分39個(gè)，基于文本挖掘方法對(duì)主要活性成分進(jìn)行補(bǔ)充后，共獲得40個(gè)主要活性化合物，見表1。

表1 主要成分及其參數(shù)Tab1 Main constituents and their parameters

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫初步檢索得到赤芍-牡丹皮藥對(duì)的作用靶點(diǎn)1190個(gè)，對(duì)40個(gè)主要活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，并對(duì)其基因名標(biāo)準(zhǔn)化處理，刪除無效和重復(fù)靶點(diǎn)后，最終獲取作用靶點(diǎn)95個(gè)。

2.2 異常子宮出血的疾病靶點(diǎn)

共篩選得到與異常子宮出血相關(guān)的疾病靶點(diǎn)共2809個(gè)，采用UniProt和Drug bank數(shù)據(jù)庫將靶蛋白統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為人源（Homo sapiens）的基因名。

2.3 赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療異常子宮出血共同靶點(diǎn)篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

共得到赤芍-牡丹皮藥對(duì)與異常子宮出血共同作用靶點(diǎn)67個(gè)，見表2；繪制Venn圖，見圖1；將67個(gè)基因在STRING平臺(tái)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并可視化處理，見圖2。統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)較多的30個(gè)節(jié)點(diǎn)并繪制出圖形，可以發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、胱天蛋白酶3（CASP3）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）等關(guān)聯(lián)程度較高，是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)最重要的節(jié)點(diǎn)蛋白，見圖3。

圖1 韋恩圖Fig1 Venn diagram

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig2 PPI network

圖3 蛋白頻次條形圖Fig3 Bar graph of target protein frequency

表2 共同作用靶點(diǎn)Tab2 Common targets

2.4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

使用cytoscape構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共86個(gè)節(jié)點(diǎn)（疾病1個(gè)，藥物2個(gè)，核心活性成分16個(gè)，靶點(diǎn)67個(gè)）和231條線，見圖4。結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、黃芩素（baicalein）、山 柰酚（kaempferol）、豆甾醇（Stigmasterol）、鞣 花 酸（ellagic acid）、兒 茶 素［（+）-catechin］等化合物可能是赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療異常子宮出血發(fā)揮治療作用的核心化合物。

圖4 藥物-化合物-作用靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig4 Drug?ingredient?target?disease network

2.5 GO基因生物過程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

GO富集分析共得到87條生物過程，選擇P值最小的20條生物過程繪制柱狀圖（見圖5a），其中DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性（DNA-binding transcription activator activity）、RNA聚合酶II特異性（RNA polymeraseⅡ-specific）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（activating transcription factor binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity），直接的配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA結(jié)合（direct ligand regulated sequence-specific DNA binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、類 固 醇 結(jié) 合（steroid binding）、核 激 素 受 體 結(jié) 合（nuclear hormone receptor binding）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（RNA polymeraseⅡtranscription factor binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）等生物過程中靶點(diǎn)較為集中。

KEGG富集分析共得到116條信號(hào)通路，選擇P值最小的20條信號(hào)通路繪制氣泡圖（見圖5b、6），靶基因主要集中在Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信號(hào)通路。

圖5 GO功能（a）與KEGG通路（b）分析Fig5 Analysis of GO function（a）and KEGG pathway（b）

圖6 KEGG通路分析圖（TNF通路）Fig6 KEGG pathway analysis（TNF signaling pathway）

3 討論

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)赤芍-牡丹皮藥治療治療異常子宮出血的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到16個(gè)主要活性成分，67個(gè)共同作用靶點(diǎn)，87條生物過程和116條信號(hào)通路。

在最終得到的16個(gè)主要活性成分中，有研究證實(shí)，槲皮素（quercetin）可以通過抑制血小板激活因子與血小板聚集起到止血的作用，此外，槲皮素還有較強(qiáng)的抗氧化作用和抗炎作用，也有研究證明它可以通過增加大腦和肌肉中線粒體的生成，清除氧自由基，從而增加運(yùn)動(dòng)耐力［10-14］。黃芩素（baicalein）可以增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平、通過調(diào)控各種蛋白和凋亡因子的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，黃芩素同樣也有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，研究證明黃芩素能明顯抑制高糖導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞從收縮型到合成型的表型轉(zhuǎn)化，而且在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體內(nèi)、外實(shí) 驗(yàn) 模 型 中 均 有 神 經(jīng) 保 護(hù) 作 用［15-19］。山 柰 酚（kaempferol）有顯著的抑制炎癥的作用，它通過抑制IKKβ的活化和IκBα的磷酸化，阻止NF-κB（p65）進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而影響相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放。也有研究證明山柰酚能夠顯著上調(diào)骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4基因的表達(dá)和AKT、GLUT4蛋白的表 達(dá)［20-22］。豆 甾 醇（Stigmasterol）與 兒 茶 素［（+）-catechin］均具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，鞣花酸（ellagic acid）可能通過抑制蛋白質(zhì)降解起到增加肌肉功能的作用，也有基礎(chǔ)研究證實(shí)其能夠抑制A431和HSC-2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡并抑制侵襲［23-25］。

IL-6、EGFR、CASP3、MAPK8和VEGFA等是赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療異常子宮出血出現(xiàn)頻次最高的幾個(gè)共同靶點(diǎn)。共同靶點(diǎn)的作用主要集中在平衡細(xì)胞增殖與凋亡、抑制異常增殖細(xì)胞的侵襲、調(diào)節(jié)激素分泌、改善細(xì)胞周期、促進(jìn)凝血、抗炎等。IL-6作為一種常見的細(xì)胞因子，在炎癥和B細(xì)胞的成熟中起重要的作用，研究證明在子宮內(nèi)膜病變過程中伴隨著IL-6的明顯過表達(dá)［26，27］。EGFR有一定的促細(xì)胞增殖作用，在許多婦科疾病中均有不同程度的高表達(dá)，子宮內(nèi)膜息肉是子宮異常出血的常見病因之一，一項(xiàng)來自新疆醫(yī)科大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉患者息肉旁內(nèi)膜組織腺體EGFR的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜的表達(dá)［28］。CASP3是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶，來自貴陽醫(yī)學(xué)院的一項(xiàng)研究證明CASP3的低表達(dá)可能促使細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不足增殖過度，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生［29］。MAPK8可以介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等，并且可以對(duì)性激素的分泌水平產(chǎn)生影響［30］。VEGFA在血管形成、腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)展、動(dòng)脈粥樣硬化等方面有重要的調(diào)節(jié)作用，一項(xiàng)來自廣州中醫(yī)藥大學(xué)的研究證明其在圍絕經(jīng)期子宮肌瘤合并異常子宮出血的患者子宮內(nèi)膜組織內(nèi)過表達(dá)，且與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子相互調(diào)控促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生和異常出血的發(fā)生。已經(jīng)有多項(xiàng)研究證明VEGFA是子宮內(nèi)膜血管形成的重要調(diào)控因子，VEGFA的表達(dá)和異常出血的發(fā)生呈正相關(guān)的關(guān)系［31-34］。

GO生物過程富集分析包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、activating激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、類固醇結(jié)合、核激素受體結(jié)合、類固醇激素受體活性等多種生物學(xué)過程，主要涉及細(xì)胞增殖和凋亡、血管內(nèi)皮保護(hù)、炎癥反應(yīng)、激素分泌、氧化與抗氧化活性等作用，并且在細(xì)胞增殖與凋亡中體現(xiàn)了高度的結(jié)合活性，可作為赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療異常子宮出血潛在的關(guān)鍵作用途徑。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果中，Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信號(hào)通路中基因較為集中。

TNF是一個(gè)炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞因子，TNF調(diào)節(jié)著很多重要的生物學(xué)活動(dòng)，如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生TNF信號(hào)主要由其細(xì)胞膜受體TNF-R1和TNF-R2介導(dǎo)［35］。通過本次KEGG富集分析得到的TNF信號(hào)通路圖中可以看到，赤芍-牡丹皮藥可能通過激活下游不同的效應(yīng)蛋白如JNK和NF-κB等，進(jìn)而調(diào)控下游的靶蛋白如炎癥細(xì)胞因子IL-6、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子NFκbia、轉(zhuǎn)錄因子Fos、細(xì)胞黏附因子Icaml等對(duì)異常子宮出血起到治療作用。

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從整體的角度對(duì)赤芍-牡丹皮藥對(duì)治療異常子宮出血的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)赤芍-牡丹皮中槲皮素、黃芩素、山柰酚、豆甾醇、鞣花酸等成分直接作用于IL-6、EGFR、CASP3、MAPK8和VEGFA等相關(guān)靶點(diǎn)起作用，并可能通過Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Fluid shear stress and atherosclerosis、Prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、Human cytomegalovirus infection、Colorectal cancer、TNF signaling pathway等信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡、保護(hù)血管內(nèi)皮保護(hù)、抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)激素分泌等作用起到對(duì)異常子宮出血的治療作用，初步對(duì)其潛在的作用機(jī)制、作用靶點(diǎn)、有效成分進(jìn)行了探索和闡釋，這也為赤芍-牡丹皮藥對(duì)未來的臨床應(yīng)用提供了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和客觀依據(jù)。