劉 武，丁 寧，姜 赫，杜廣華，宋 雙，張 詔

（山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）的發(fā)病率約占糖尿病患者總發(fā)病人數(shù)的40%，是一種糖尿病微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的最常見(jiàn)因素［1，2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在2015年，全球大約有4.15 億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2040年，糖尿病患者將上升至6.42 億人。1990～2012年，DKD導(dǎo)致的死亡率達(dá)到94%，是造成全球疾病負(fù)擔(dān)的重要原因之一，因此，對(duì)DKD的治療至關(guān)重要［1］。DKD發(fā)生機(jī)制已被證實(shí)與炎癥反應(yīng)、膜結(jié)合Toll樣受體、核苷酸結(jié)合寡聚域等有關(guān)，受Wnt信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路以 及PI3K/AKT等 多 種 信 號(hào) 通 路 的 調(diào) 控［2，3］。目前，對(duì)DKD的治療尚無(wú)特效措施，主要是對(duì)癥治療，即控制血糖、血壓、血脂、蛋白尿等，至其發(fā)展到終末期腎衰竭則選擇腎臟替代。現(xiàn)已有大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥在治療DKD，延緩腎臟病理進(jìn)展方面起到了重要作用，具有較好的療效和安全性［4，5］。

真武湯源自張仲景的《傷寒論》，其藥物組成為附子、茯苓、白術(shù)、白芍、生姜，整方具有溫陽(yáng)利水之效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)擴(kuò)展其應(yīng)用于臨床多種疾病的治療，其治療腎病綜合征、慢性腎小球腎炎、DKD等腎臟疾病的療效顯著［6］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，真武湯對(duì)于痰瘀互結(jié)證2型糖尿病腎病患者具有良好的臨床療效，且能夠改善血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平［7］。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，真武湯能夠降低血清胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor1，IGF-1）水平，使組織中IGF-1明顯下調(diào)，以保護(hù)腎臟功能［8，9］。真武湯治療DKD療效顯著，但是真武湯由五種藥物組成，化學(xué)成分復(fù)雜，對(duì)于其治療DKD的靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚未明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠系統(tǒng)地反映藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制，體現(xiàn)中醫(yī)藥復(fù)方的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特征，有利于揭示中醫(yī)藥復(fù)方的科學(xué)性［10］。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過(guò)構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，以探究真武湯治療DKD的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用真武湯提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 真武湯中藥物及其潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine System Pharmacology，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)分別檢索真武湯中單味藥：茯苓、白芍、生姜、白術(shù)、附子的化學(xué)成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，且類藥性（DL）≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，得出相應(yīng)有效成分化合物信息。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得的成分靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范統(tǒng)一。

1.2 DKD的疾病靶點(diǎn)收集

在人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecards）、人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、Therapeutic Target Databas數(shù) 據(jù) 庫(kù)（TTD）中 以“diabetic nephropathy”、“diabetic kidney disease”為檢索詞，獲取DKD的疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 真武湯治療DKD靶點(diǎn)篩選

利用生物信息學(xué)與進(jìn)化基因組學(xué)網(wǎng)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/）將真武湯有效成分靶點(diǎn)與DKD疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分析合并，繪制Venn圖，將其交集作為作用于方藥對(duì)疾病的直接作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集所得到的靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值為“medium confidence（0.400）”，余為默認(rèn)值，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 真武湯成分-DKD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將真武湯中各味中藥及其化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)以及DKD疾病靶點(diǎn)上傳至Cytoscape3.7.2 軟件中，構(gòu)建中藥-化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO富集分析與KEGG通路分析

將交集所得到的靶點(diǎn)上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO富集分析，包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）、分子 功 能（molecular function，MF）及KEGG通 路分析。

2 結(jié)果

2.1 真武湯藥物活性化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)

通過(guò)TCMP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索真武湯中活性化學(xué)成分，根據(jù)所設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18 為條件篩選，初步獲取白芍活性化學(xué)成分13個(gè)，附子21個(gè)，白術(shù)7個(gè)，茯苓15個(gè)，生姜5個(gè)，去重后共得到59個(gè)化學(xué)成分。在TCMP數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜索得到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)281個(gè)，運(yùn)用Uniprot進(jìn)行蛋白標(biāo)準(zhǔn)化命名，最終去重后得到靶蛋白103個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 真武湯主要活性成分Tab1 Main active constituents of Zhenwu Tang

2.2 DKD相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，收集到DKD相關(guān)靶點(diǎn)11247個(gè)，DN相關(guān)靶點(diǎn)3082個(gè)，設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為DKD潛在靶點(diǎn)，最終篩選獲得DKD相關(guān)靶點(diǎn)1408個(gè)，DN相關(guān)靶點(diǎn)1541個(gè)；通過(guò)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索收集到DKD相關(guān)靶點(diǎn)475個(gè)，DN相關(guān) 靶 點(diǎn)252個(gè)；通過(guò)TTD數(shù)據(jù) 庫(kù)搜索收 集到DN相 關(guān)靶點(diǎn)19個(gè)，DKD相 關(guān)靶點(diǎn)1個(gè)，合并去重后最終得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)2569個(gè)。

2.3 真武湯靶點(diǎn)與DKD靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將真武湯獲得的靶點(diǎn)基因與DKD潛在靶點(diǎn)取交集后，獲得共用靶點(diǎn)66個(gè)，制作韋恩圖，見(jiàn)圖1。將獲得的靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中共有66個(gè)節(jié)點(diǎn)，505條邊，平均degree值為15.3 。通過(guò)Cytoscape3.7.2 中的cytoHubba插件以MCC算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中各個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選排名前10位的靶點(diǎn)，如圖3。

圖1 真武湯-DKD靶點(diǎn)韋恩圖Fig1 Venn diagram of Zhenwu Tang-DKD targets

圖2 真武湯-DKD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig2 PPI network of Zhenwu Tang-DKD targets

圖3 基于MCC算法的前十位Hub基因Fig3 Top10hub genes based on MCC algorithm

2.4 真武湯成分-DKD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape3.7.2 構(gòu)建真武湯中中藥各化學(xué)成分-DKD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。運(yùn)用Cytoscape3.7.2 中的NetworkAnalyzer分析得出各參數(shù)的degree值，degree值排名前5的化學(xué)成分是：β-谷甾 醇（β-sitosterol）、山 柰 酚（kaempferol）、豆 甾 醇（stigmasterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮（3β-acetoxyatractylone）。

圖4 真武湯成分-DKD-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig4 Network of Zhenwu Tang components-DKD-targets

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將上述66個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入至DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，真武湯參與的生物過(guò)程（BP）包括藥物反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)等，參與膜筏、細(xì)胞膜穴樣凹陷、質(zhì)膜、細(xì)胞外空隙等細(xì)胞組分（CC），參與酶結(jié)合、蛋白同源二聚化、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活動(dòng)等分子功能（MF），對(duì)BP、CC、MF中排名前十的條目繪制氣泡圖，見(jiàn)圖5～7。KEGG通路分析最終獲得100條信號(hào)通路，主要涉及hepatitis B、TNF信號(hào)通路、腫瘤信號(hào)通路等，對(duì)排名前十的條目繪制氣泡圖，見(jiàn)圖8。

圖5 GO生物過(guò)程富集分析Fig5 GO biological process enrichment analysis

圖6 GO細(xì)胞組分富集分析Fig6 GO cellular component enrichment analysis

圖8 KEGG通路分析Fig8 KEGG pathway analysis

圖7 GO分子功能富集分析Fig7 GO molecular function enrichment analysis

3 討論

根據(jù)DKD的臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，中醫(yī)將其歸為“水腫”、“尿濁”等范疇，本病的發(fā)生多因飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞倦內(nèi)傷、先天稟賦不足等所致，由消渴病發(fā)展而來(lái)。如《圣濟(jì)總錄》所言：“消渴病久，腎氣受傷”、“此病久不愈，能為水腫癰疽之病”，消渴病日久傷及腎氣，腎氣受傷，精微不固，流失則成尿濁，水液代謝失常，犯溢肌膚又發(fā)為水腫，最終發(fā)展為消渴病腎病。本病與肺、脾、腎三臟相關(guān)，而多從脾腎立論，為本虛標(biāo)實(shí)之癥，以脾腎虧虛為本，瘀血、痰濁、濕熱等邪氣稽留為標(biāo)?，F(xiàn)代醫(yī)家對(duì)DKD的認(rèn)識(shí)不斷發(fā)展，南征［11］認(rèn)為氣虛、陽(yáng)虛、痰凝、氣滯、瘀血等多種病理因素相互作用、互為標(biāo)本，導(dǎo)致臟腑氣機(jī)失調(diào)，陰陽(yáng)失衡，其中毒邪寓于諸邪之中，為共性因素，最終提出毒損腎絡(luò)是消渴腎病的病機(jī)關(guān)鍵。高亞斌等［12］認(rèn)為內(nèi)熱為DKD的始動(dòng)因素，內(nèi)熱日久傷及血分，化瘀生痰，郁結(jié)腎絡(luò)，形成癥瘕，DKD的核心病機(jī)即為“內(nèi)熱致癥”。

真武湯可用于DKD脾腎陽(yáng)虛，水濕內(nèi)蘊(yùn)之證，以溫補(bǔ)脾腎之陽(yáng)，化濁利水。方中以附子溫腎陽(yáng)，暖脾土，用為君藥，使水濕得以運(yùn)化。以茯苓、白術(shù)為臣藥，行健脾燥濕、滲濕之功，使?jié)裥白孕”愣?。白芍為佐，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂“利小便”，在此利小便以行水氣，且能夠制約君藥附子之燥烈，舒筋緩急止痛。生姜亦能溫陽(yáng)散寒，以助附子散水濕。本研究通過(guò)對(duì)真武湯中5味中藥活性化學(xué)成分進(jìn)行分析，構(gòu)建真武湯活性化學(xué)成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵化學(xué)成分為β-谷甾醇（β-sitosterol）、山柰酚（kaempferol）、豆甾醇（stigmasterol）、常春藤皂苷元（hederagenin）、3β-乙酰氧基蒼術(shù)酮（3βacetoxyatractylone）。β-谷甾醇是一種植物固醇，與膽固醇結(jié)構(gòu)相似，能夠參與多種細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)程，包括細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移、炎癥等［13］，且具有抗糖尿病、降血脂、抗癌等多種作用［14］。Babu等［15］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇與受體后胰島素信號(hào)分子β-arrestin-2，c-Src和IRS-1以及Akt蛋白具有高親和力，能夠減弱胰島素抵抗，減輕高脂飲食所引起的脂肪組織有害變化。豆甾醇與β-谷甾醇均為甾醇類提取物，在葡萄糖利用及肝糖原降解途徑方面起到重要作用，研究表明，豆甾醇與β-谷甾醇均能夠使糖異生酶及丙酮酸激酶恢復(fù)正常水平，使糖尿病大鼠的β細(xì)胞明顯再生［16］。山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌以及心臟保護(hù)等功能，是一種常見(jiàn)的飲食類黃酮化合物［17］，研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠抑制高血糖環(huán)境下NRK-52E、RPTEC細(xì)胞中RhoA的活化并降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、促炎性因子的表達(dá)以及延緩纖維化形成［18］。研究表明［19］，常春藤皂苷元亦具有抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、保肝等作用，常春藤皂苷元能夠抑制IL-6、TNF-α以及COX-2等促炎細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，且能夠通過(guò)促進(jìn)AKT、ERK的激活以阻止p38MAPK的激活，參與抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，本研究推測(cè)真武湯治療DKD的關(guān)鍵 靶點(diǎn)主 要包括TNF、AKT1、IL6、PTGS2、MAPK8等。既往研究發(fā)現(xiàn)，DKD的發(fā)病機(jī)制與炎癥因子的介導(dǎo)關(guān)系密切［20］，本研究所得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)中，TNF-α、IL6是參與炎癥反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，可以由脂肪細(xì)胞分泌，能夠參與能量代謝、葡萄糖和脂質(zhì)代謝等，在生殖、心血管以及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)方面起到重要作用［21］。高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，增加微血管通透性，并刺激炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL6等的分泌以促進(jìn)加重炎癥反應(yīng)［22］。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調(diào)節(jié)胰島素代謝。研究表明［23，24］，AKT1是PI3K/AKT通 路 的重要因 子，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞存活等方面起到了重要作用，且胰島素能夠通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路以調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞功能。PTGS2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的主要酶，PTGS2誘導(dǎo)的前列腺素合成能夠刺激細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管生成，抑制細(xì)胞凋亡并且能夠增加轉(zhuǎn)移潛力［25］。

KEGG通路富集分析顯示，真武湯調(diào)控DKD的主要通路有hepatitis B、TNF、腫瘤信號(hào)通路等，這些通路大多參與炎癥反應(yīng)過(guò)程。其中hepatitis B信號(hào)通路能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)等［26］。TNF信號(hào)通路中的TNF是一種促炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等方面起到了重要作用，從而影響DKD的發(fā)病機(jī)制［22］。

綜上所述，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)闡述了真武湯的活性化學(xué)成分以及其治療DKD多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制過(guò)程，為進(jìn)一步探究真武湯治療DKD的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。但本文仍然存在一定的局限性，本文僅依據(jù)生物信息學(xué)等數(shù)據(jù)挖掘OB≥30%，DL≥0.18 的活性化學(xué)成分，但仍有部分化學(xué)成分未納入數(shù)據(jù)處理，且部分化學(xué)成分未在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。本研究仍需進(jìn)行動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，以期為真武湯治療DKD提供更為清晰的理論依據(jù)。