木薯MeHSF10基因克隆及表達(dá)分析

曾堅 張燕秋 陳麗萍 吳春來 胡偉

摘 要：熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor，HSF）是植物中重要的逆境調(diào)控因子。許多研究表明HSF可通過對信號通路下游的逆境相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控而提高植物適應(yīng)逆境的能力，如提高植株在干旱和氧化損傷等逆境中的耐受能力。為研究HSF在木薯抗逆和采后儲存中的功能，該研究以木薯品種SC124為材料，通過RT-PCR技術(shù)從木薯葉片克隆得到一個木薯HSF家族基因，將其命名為MeHSF10。結(jié)果表明：（1）該基因全長為1 098 bp，編碼365個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)相對分子量為40.7 kD，理論等電點為8.15，蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核。蛋白質(zhì)序列分析結(jié)果表明MeHSF10與麻風(fēng)樹JcHSF和橡膠樹HbHSF的相似性最高，分別為80.31%和90.54%。MeHSF10基因的蛋白序列含有HSF蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域，如DBD、HR-A Core、HR-B Core、插入序列和核定位信號 （nuclear localization signal，NLS），表明MeHSF10基因編碼的蛋白質(zhì)屬于HSFC家族成員。（2）為分析MeHSF10基因在木薯不同組織中的表達(dá)情況，對該基因在木薯11個組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明MeHSF10基因在木薯所有組織中都有表達(dá)，在葉片中的表達(dá)最高。（3）MeHSF10基因的啟動子序列元件分析結(jié)果顯示其含有脫落酸（abscisci acid，ABA）響應(yīng)（ABA responsive motif）、干旱誘導(dǎo) （drought-induced motif）和光響應(yīng) （light-responsive motif）等元件。（4）表達(dá)分析結(jié)果也表明，MeHSF10基因能被干旱和ABA處理顯著誘導(dǎo)，MeHSF10基因在木薯塊莖的采后生理性變質(zhì)過程中也被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。綜上結(jié)果表明，MeHSF10基因可能在轉(zhuǎn)錄水平參與ABA介導(dǎo)的木薯干旱脅迫響應(yīng)和木薯塊莖的采后生理性變質(zhì)，這為進(jìn)一步研究其在木薯抗逆和采后儲存中的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：熱激轉(zhuǎn)錄因子，MeHSF10，非生物脅迫，采后生理性變質(zhì)（PPD），表達(dá)分析

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）09-1576-09

Abstract：Heat shock transcription factor （HSF）is a key adverse regulatory factor in plants. Many studies have shown that HSFs can partake in the downstream of signal transduction pathways and regulate genes expression responsive for a variety of abiotic/biotic stresses，to improve the tolerance to high salinity and oxidative stress in plants. In order to analyze the function of HSF in stress tolerance and post-harvest storage of Manihot esculenta，M. esculenta cv. SC124 was used as cloning material. In this study，a HSF gene designated MeHSF10 was isolated from M. esculenta leaves through RT-PCR method. The results were as follows：（1）The full-length cDNA of MeHSF10 was 1 098 bp，encoded a polypeptide of 365 amino acid residues with a predicted relative molecular mass of 40.7 kD and an isoelectric point of 8.15. Subcellular localization of MeHSF10 was predicted as nuclear localization. Multiple protein sequence alignment showed that MeHSF10 shared a significant degree of sequence similarity with other HSF proteins in Jatropha curcas （80.31 %）and Hevea brasiliensis （90.54 %）. The protein sequence of MeHSF10 contained conserved motifs of the HSF family，such as DNA Binding Domain （DBD），HR-A Core，HR-B Core，insert sequence，and nuclear localization sequence signal （NLS），these results suggested that MeHSF10 isolated from M. esculenta was a genuine member of the HSFC family. （2）In order to analyze the expression profiles of MeHSF10 gene in M. esculenta，the expression data of eleven M. esculenta tissues/organ types were analyzed，and the result showed that MeHSF10 gene expressed in all eleven M. esculenta tissues，and the highest expression of MeHSF10 was in leaf. （3）Results of promoter element analysis revealed that MeHSF10 contained drought-induced motif （MBS），ABA responsive motif （ABRE），and several light-responsive motifs. （4）The transcriptome data results also showed that MeHSF10 was upregulated by drought stress and ABA treatment. The expression of MeHSF10 was also induced in M. esculenta post-harvest physiological deterioration （PPD）process. All the above results indicate that MeHSF10 may be involved in ABA mediated drought stress response，and that MeHSF10 is also related with PPD and may operate mainly through ROS-regulated gene networks. Therefore，these results offered critical basic knowledge for future gene function analysis of MeHSF10 in stress tolerance and post-harvest storage of Manihot esculenta.

Key words：heat shock transcription factor （HSF），MeHSF10，abiotic stress，post-harvest physiological deterioration （PPD），expression analysis

植物在漫長的進(jìn)化過程中已經(jīng)進(jìn)化出了應(yīng)對各種逆境的抵御機(jī)制 （Ohama et al.，2017）。研究結(jié)果表明，熱休克反應(yīng)在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中具有重要作用，熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat shock transcription factor，HSF）是其中重要的調(diào)控因子，HSF可通過對信號通路下游的逆境相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控而提高植物適應(yīng)逆境的能力。HSF能夠提高植株在熱、干旱和氧化損傷等逆境中的耐受能力，在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中具有非常重要的作用（Guo et al.，2016; Jiang et al.，2018; Zhou et al.，2018）。HSF還能夠提高植物適應(yīng)不同非生物脅迫的能力，如TaHSFA4a可提高水稻在重金屬環(huán)境中的生存能力 （Shim et al.，2009）;SlHsfA1可提高番茄在高溫環(huán)境的生存能力 （Scharf et al.，2012）;CarHsfB2可提高擬南芥在干旱環(huán)境中的生存能力（Hao et al.，2016）;AtHSFA6a和AtHSFA6b也可提高擬南芥在高鹽和低溫環(huán)境中的生存能力;AtHSFA2可提高擬南芥在高滲、高鹽和高氧化水平環(huán)境中的生存能力（Miller & Mittler，2006; Banti et al.，2010）。因此，不同物種的HSF基因均能提高不同植株應(yīng)對不同逆境脅迫的能力。

木薯（Manihot esculenta）是廣泛種植于熱帶及亞熱帶地區(qū)的重要糧食作物。在我國，木薯種植面積5.0×105 hm2，年產(chǎn)量約1.0×1010 kg，年產(chǎn)值超過140億元，是我國熱帶和亞熱帶地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物 （張鵬等，2014）。木薯是我國和世界上具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ哪茉粗参铮捎糜谏a(chǎn)工業(yè)淀粉，燃料乙醇，生物基材料（張鵬等，2014;Hu et al.，2016;顏彥等，2018）。木薯本身擁有較好的抗旱和耐貧瘠等特點，隨著綠色能源需求的不斷增加，木薯作為生物質(zhì)能源的潛力越來越被重視。此外，木薯塊根采后易出現(xiàn)“采后生理性變質(zhì)”（post-harvest physiological deterioration，PPD），導(dǎo)致其儲藏期時間短，嚴(yán)重影響了其在工業(yè)生產(chǎn)中的開發(fā)利用（Zidenga et al.，2012;張振文和李開綿，2012;Xu et al.，2013）。目前，關(guān)于HSF基因在木薯中的功能研究還鮮有報道 （Wei et al.，2018，Yu et al.，2019）。因此，克隆木薯HSF相關(guān)基因并進(jìn)行表達(dá)分析，對深入研究其在木薯抗逆過程和PPD過程中的表達(dá)調(diào)控作用具有重要意義。本研究利用前期木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過PCR技術(shù)克隆到一個熱激轉(zhuǎn)錄因子MeHSF10基因，并對其編碼蛋白序列、保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行初步分析，同時，也對MeHSF10在干旱脅迫、ABA處理和PPD過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為研究MeHSF10基因功能及抗逆分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究選用的木薯材料為SC124品種（Manihot esculenta cv. SC124），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所保存。植物RNA提取試劑盒（貨號：DP437）購自天根生化科技有限公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：K1622）購自Fermentas 公司。PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 材料處理

將木薯莖稈切成合適長度的小節(jié)（包含3～4個芽點），將其種入蛭石和營養(yǎng)土比例為1∶1（V/V）的基質(zhì)中生長。待生長約60 d后，選取生長狀況一致的木薯幼苗作為后續(xù)實驗材料。采用20%（W/V）PEG-6000進(jìn)行干旱模擬處理，對照植株澆灌水，在處理0、3、5、7 d后采集木薯葉片樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存;使用100 μmol·L-1 ABA進(jìn)行澆灌，在處理0、3、5、7 d后采集木薯葉片樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存;取生育期10個月的木薯塊根，置于25 ℃、70% 相對濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)，分別在0、6、12、48 h取樣，采集的木薯樣品用液氮速凍后放入超低溫冰箱保存，每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 基因克隆

分別使用RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)木薯同源序列（Manes.02G087400.1）設(shè)計引物 （P1：5′-ATGAGCAAAAAAGAAAAAAAAG-3′; P2：5′-CTAAAAGCCACCACCTAAAAGCG-3′），以木薯葉片cDNA為模板進(jìn)行MeHSF10基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并挑選陽性單克隆進(jìn)行測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用NCBI中的BLASTp搜索其他物種中和MeHSF10同源的蛋白質(zhì)序列;使用Plant-mPLoc軟件預(yù)測亞細(xì)胞定位;使用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域;通過ExPASy ProtParam計算蛋白質(zhì)的理論等電點和相對分子質(zhì)量;采用DNAMAN6軟件進(jìn)行序列比對;利用MEGAX中的Neighbor-Joining （NJ）法構(gòu)建進(jìn)化樹;采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物;利用Plantcare進(jìn)行啟動子元件分析 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.5 基因的表達(dá)分析

將相應(yīng)處理的樣品提取RNA，建庫并測序，這部分工作由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。測序平臺是Illumina GAII （Illumina，San Diego，CA，USA）。使用FASTX-toolkit （http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）移除接頭序列和低質(zhì)量序列;利用Tophat 2.0 （Trapnell and Pachter LSalzberg，2009）軟件將clean reads和木薯基因組參考序列 （version 4.1）進(jìn)行比對，將比對結(jié)果用Cufflinks （Trapnell et al.，2012）來組裝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄本至少存在于兩個樣本中才保留。ABA處理、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）處理和PPD過程中的基因表達(dá)水平使用FPKM （Fragments per kilobase per million mapped reads）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeHSF10基因的克隆

利用擬南芥AtHSF8基因 （登錄號：AT3G24520）的蛋白質(zhì)序列為參考序列，在Phytozome數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp比對搜索，得到了一個和木薯相似性較高的基因序列（Manes.16G116200.1）。根據(jù)該基因設(shè)計引物后進(jìn)行擴(kuò)增，對目的基因進(jìn)行測序后得到一個全長為1 098 bp的片段（圖1），編碼365個氨基酸，將其命名為MeHSF10基因。MeHSF10基因和參考序列之間存在1個堿基差異，屬于同義突變（圖2）。MeHSF10基因序列含有1個內(nèi)含子和2個外顯子。MeHSF10蛋白的分子式預(yù)測為C1790H2849N501O551S17，相對分子量40.7 kD，理論等電點為8.15，不穩(wěn)定系數(shù)為60.57，屬于不穩(wěn)定蛋白。蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析顯示MeHSF10包含有HSF家族結(jié)構(gòu)域（圖3），進(jìn)一步證明克隆得到的基因為木薯HSF基因。

2.2 MeHSF10氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用MeHSF10基因的蛋白質(zhì)序列為探針，進(jìn)行Blast搜索，下載同源性較高的序列，其中與橡膠樹 （XP_021643078.1）和麻風(fēng)樹 （XP_020535025.1）的氨基酸序列相似性最高，分別為90.54%和80.31%。多重序列比對結(jié)果顯示，MeHSF10基因的蛋白序列含有HSF蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。在N端6～100氨基酸殘基位置含有高度保守的DNA Binding Domain （DBD），在N端170～210氨基酸殘基位置含有HR-A Core、HR-B Core和插入序列，在N端227～242氨基酸殘基位置含有核定位信號 （nuclear localization signal，NLS），這些結(jié)果表明MeHSF10基因編碼的蛋白質(zhì)屬于HSFC家族成員。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，木薯MeHSF10和橡膠樹的HbHSF聚在一起，氨基酸序列一致性最高（圖5）。

2.3 ?MeHSF10 基因的組織表達(dá)分析

本研究通過下載得到木薯11個沒有經(jīng)過任何處理的組織的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行研究MeHSF10基因在木薯不同組織中的表達(dá)變化情況 （shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）。它們分別是葉（L），中脈（M），葉柄（P），莖（S），側(cè)芽（LB），頂端分生組織（SAM），根（SR），須根（FR），根頂端分生組織（RAM），分化胚組織（OES），松散性胚性愈傷組織（FEC）。結(jié)果顯示MeHSF10基因在不同組織中的表達(dá)水平不一樣，在葉片中的表達(dá)水平最高，在分化程度較低的組織FES、RAM和SAM中的表達(dá)水平較低（圖6）。

2.4 MeHSF10基因在不同脅迫條件下的表達(dá)分析

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)，通過對MeHSF10基因起始密碼子上游1 500 bp的序列進(jìn)行啟動子元件分析，結(jié)果表明啟動子中包含1個干旱誘導(dǎo)元件MBS、3個ABA響應(yīng)元件ABRE （表1）。因此，在ABA處理和模擬干旱脅迫下對MeHSF10基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明MeHSF10基因在ABA處理下表達(dá)上調(diào)，在模擬干旱脅迫下表達(dá)也上調(diào)，分別最高提高了2.3倍和2.4倍（圖7）。

為研究MeHSF10基因與木薯塊根采后生理性變質(zhì)（PPD）過程之間的關(guān)系，對MeHSF10基因在木薯采后生理性變質(zhì)過程中的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示在采后生理性變質(zhì)過程中MeHSF10基因的表達(dá)明顯受到誘導(dǎo)，在6 h時沒有顯著變化;而12 h時達(dá)到最高水平，提高了約4.3倍;48 h后表達(dá)水平下降，但仍然高于0 h （圖8）。

3 討論與結(jié)論

熱激轉(zhuǎn)錄因子在自然界中有多個基因家族成員，它們含有不同的保守結(jié)構(gòu)域，如DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain，DBD）、寡聚化功能域（oligomerization domain，OD）、核定位信號（nuclear localization singal，NLS）等。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域OD的特點可以分為HSFA、HSFB和HSFC三個家族 （Guo et al.，2016）。不同植物中擁有不一樣的HSF家族數(shù)量，例如：擬南芥中有21個，水稻中25個，玉米中25個，小麥中則超過56個。這些植物中都含有HSF基因家族的保守結(jié)構(gòu)域，并有其相關(guān)功能研究（Guo et al.，2008;Mittal et al.，2009; Lin et al.，2011;Scharf et al.，2012;Xue et al.，2014），而關(guān)于木薯的報道較少。本研究分離的MeHSF10基因序列全長為1 098 bp，編碼365個氨基酸。序列分析表明，該基因含有HSFC家族的保守結(jié)構(gòu)域 （李菲等，2017），系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示MeHSF10與橡膠樹HbHSF和麻風(fēng)樹JcHSF的親緣關(guān)系較近。

HSF基因在所有的水稻組織中都有表達(dá)，而HSF9則只在向日葵和擬南芥的種子中表達(dá)（Almoguera et al.，2002;Scharf et al.，2012），番茄花粉組織中的HSFA2相比其他花組織表現(xiàn)出更高的表達(dá) （Guo et al.，2016）。因此，不同HSF基因會由于功能的差異在不同植物的不同組織中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。MeHSF10基因的啟動子序列分析結(jié)果顯示其含有大量的光誘導(dǎo)元件，而MeHSF10在葉片中的表達(dá)水平最高，因而推測該基因可能與葉片中的光合作用相關(guān)。

啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，MeHSF10基因的啟動子序列分析結(jié)果顯示其含有干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS和ABRE元件。因此，本研究分別對木薯進(jìn)行干旱和ABA處理，結(jié)果表明MeHSF10基因的表達(dá)明顯受到干旱脅迫和ABA處理的誘導(dǎo)。在擬南芥中，AtHsfA9通過ABA信號通路提高植株應(yīng)對干旱脅迫的能力 （Guo et al.，2008），過表達(dá)AtHSFA2和AtHSFA8基因可提高擬南芥植株對鹽和滲透脅迫的適應(yīng)能力;過表達(dá)OsHSF29和OsHSF17基因可以提高水稻植株對鹽和滲透脅迫的適應(yīng)能力 （Jin et al.，2013）。因此，推測MeHSF10可能通過依賴于ABA信號通路的途徑來響應(yīng)干旱脅迫，但具體是哪些基因參與了MeHSF10介導(dǎo)的分子調(diào)控仍不清楚。MeHSF10在木薯生理性變質(zhì)過程中的高表達(dá)則表明，該基因可能和木薯塊莖的生理性變質(zhì)相關(guān)。研究報告指出HSF和植物應(yīng)對氧化脅迫密切相關(guān)，在水稻中OsHsfC2a和OsHsfA5是植株ROS感知和含量積累的重要基因（Miller et al.，2008; Mittal et al.，2009）。在煙草中，過表達(dá)胡楊PeHSF基因則通過調(diào)節(jié)葉片中的ROS平衡提高煙草應(yīng)對非生物逆境脅迫的能力 （Shen et al.，2013）。因此，推測MeHSF10可能和氧化脅迫相關(guān)，進(jìn)而影響木薯塊莖的生理性變質(zhì)。但MeHSF10基因如何參與木薯塊莖的生理性變質(zhì)仍不清楚。因此，對這些結(jié)果的進(jìn)一步研究將有可能為木薯的抗逆和延緩生理性變質(zhì)提供理論參考。下一步將通過對基因功能的研究來驗證該基因在木薯抗旱和延緩生理性變質(zhì)中的作用。

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（責(zé)任編輯 李 莉）